自制活性干酵母发酵菠萝果酒适宜条件探讨

王 玲，尚云青，匡 钰，张美欣

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.云南中医学院，云南昆明650500；3.云南省德宏热带作物科学研究所，云南德宏 678600）

菠萝（Ananas comosus）学名凤梨，是著名的热带、亚热带特产水果之一，成熟时不仅色泽鲜艳，而且气味芳香、味道清甜、深受广大消费者的喜爱。分析测试结果表明：菠萝鲜果中含水量达80%以上，还含有大量的还原糖，维生素A、B、C，磷和柠檬酸等，且糖酸比例合适[1]，非常适合于酿酒。由菠萝汁酿成的菠萝酒营养分丰富，是一种兼具营养与保健价值的低度果酒[2]。但目前菠萝果酒的生产由于没有专用的酵母菌，而大多采用市售的葡萄酒用活性干酵母进行发酵，产品缺乏菠萝果实特有的香气，风味欠佳。针对这些问题，本课题组之前对菠萝果酒发酵专用菌种进行了筛选[3]，并在近期制作成了活性干酵母，本研究对自制的活性干酵母发酵菠萝果酒的适宜条件进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝 八成熟，无刺卡因种，湛江鹰峰食品有限责任公司生产基地；菠萝果酒活性干酵母 以自行筛选的优良酵母菌为出发菌株，在一定的条件下对酵母菌进行培养，真空冷冻干燥制得的活性干酵母；柠檬酸、无水亚硫酸钠 均为分析纯；HR1861榨汁机 珠海飞利浦家用电器有限公司；SPX-250B恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HZQ-F-160振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析检测方法 总酸（以柠檬酸计，g/100mL）酸碱滴定法[4]；酒度（v/v，20℃） 蒸馏法[5]；总糖（g/100mL）GB/T 15037-2006葡萄酒及果酒中总糖的测定[6]；二氧化硫（mg/L）GB/T 5009.34-2003食品中亚硫酸盐的测定[7]；菌落总数测定（cfu/mL）GB/T 4789.2-2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定[8]；大肠菌群测定 大肠菌群MPN计数法，按GB/T 4789.2-2010执行[9]。

1.2.2 菠萝果酒生产工艺

1.2.3 操作要点 选取八成熟的无病虫害且无霉烂变质的新鲜菠萝果实，经预处理后榨汁，调节菠萝汁的糖酸，向菠萝汁中加入一定量的SO2抑制杂菌生长，取一定量的自制菠萝酒用活性干酵母复水活化后，进行酒精发酵。

1.3 菠萝果酒发酵工艺条件的单因素实验

菠萝汁的发酵温度、pH、初始糖度及接种量四因素是影响菠萝果酒发酵质量的主要因素。分别设计在26、28、30、32、34℃的发酵温度；pH为4、4.5、5、5.5、6；初始糖度为15、17、19、21、23°Brix；接种量分别为2%、3%、4%、5%、6%的条件下发酵6d，以生成的酒精度为考核指标，对菠萝果酒发酵工艺条件进行单因素实验。

1.4 菠萝果酒发酵工艺条件的优化

在初始糖度、发酵温度、pH、接种量单因素实验的基础上，采用二次回归旋转组合设计[10]来进行发酵条件的优化，二次回归设计参数为p=4，mc=16，γ=2.000，m0=12，n=36，实验的因素水平编码表见表1。

2 结果与分析

2.1 菠萝果酒发酵工艺条件的单因素实验

2.1.1 发酵温度对菠萝果酒发酵的影响 发酵温度对果酒的发酵有很大影响，如果温度过高，虽然可提高发酵速度，但容易使微生物细胞活性快速降低，发酵能力减弱；温度太低，在发酵初期容易感染杂菌造成发酵失败。由图1可知，在26～34℃的选定的实验点温度范围内，32℃条件下的发酵温度比较理想。

2.1.2 pH对菠萝果酒发酵的影响 pH对菠萝果酒发酵的影响如图2所示。随着pH的增加，酵母菌酒精产率先增强后减弱，pH为5.5时达到最大。所以，菠萝果酒发酵液的理想pH为5.5。

2.1.3 初始糖度对菠萝果酒发酵的影响 初始糖度对菠萝果酒发酵的影响如图3所示。从图3中可以看出，初始糖度在21°Brix之前，酒精度随着初始糖度的增加而增高，但之后糖度增加，酒精生成量反而下降，这主要是因为糖含量太高，酵母细胞的渗透压增大，对酵母菌细胞内酶的活性产生一定的影响，所以，21°Brix生成的酒精度比较理想。

2.1.4 接种量对菠萝果酒发酵的影响 接种量直接影响菠萝果酒发酵的酒精度，接种量太低，不但发酵速度变得缓慢，而且容易使发酵液在发酵初期感染杂菌，影响发酵进程；接种量太高，虽然发酵初期可提高发酵速度，但会造成酒液发酵后劲不足。由图4可以看出，接种量为5%时，酒精生成量较高。

2.2 菠萝果酒发酵工艺条件的优化

根据菠萝果酒发酵的单因素实验结果，按照表1的方法对菠萝果酒发酵进行四因素二次回归正交旋转设计实验以确定最优工艺条件，结果如表2所示。

根据实验结果，以发酵酒精度为响应值，运用SAS RSREG（response surface regression）程序[11]对36个实验点响应值进行回归分析，结果见表3、表4。

由表3、表4分析结果可以看出，因素X1（温度），X2（pH）、X3（初始糖度）和X4（接种量）对酒精度呈极显著（p＜0.01）影响，因素X1X2、X1X4、X2X3、X3X4对响应值的曲面效应也呈现极显著影响，由此可以得出结论为：温度、pH、初始糖度和接种量是菠萝果酒发酵工艺中重要的影响因素，根据F值的大小，确定四个因素对发酵酒度的影响大小为：X3＞X2＞X1＞X4，即：初始糖度＞pH＞温度＞接种量。

经SAS回归拟合后，各实验因子对响应值酒精度的影响可以通过回归方程表示为：

Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.28232-0.3037-0.1948-0.4948，模型可信度分析见表5。

综合表3～表5可知，用回归方程描述各实验因子与响应值酒精度之间的关系时，其因变量酒精度与全体自变量包括温度、pH、初始糖度、接种量之间的多元回归关系显著，复相关系数的平方（R2）为0.9573，表明该模型理论上可以反映响应值的95.73%。响应值的变异系数（C.V.%）为3.1086，方程模型F值为33.67，远远大于F0.01（14，15）=3.8的数值，总的回归关系达到极显著水平，表明实验设计合理，回归方程在选取的实验点上与实验结果拟合得较好。同时，方程失拟项的F值为1.99，p值为0.138（p＞0.05），失拟检验不显著，表明回归方程在整个回归区域的拟合情况良好，即采用该模型是合理的，可以用该方程对不同发酵条件下的发酵酒度进行预测。

模型优化参数分析可得酒精度最大值所需要的参数条件为：温度为33.68℃，pH5.609，初始糖度20.60%，接种量5.48%。在此最优工艺下酒精度预测值为8.74%。

为进一步检验该预测模型的可靠性，采用该模型最优化分析所得出的方案通过修整进行菠萝果酒发酵实验[12]，实际操作条件调整为：温度33.7℃，pH5.6，初始糖度20.5%，接种量5.5%，重复3次实验取平均值，实际测得的酒精度为8.7%±0.2%。在显著性水平p＜0.05的前提下，预测值与实际值无显著性差异。由此可得，采用二次回归正交旋转设计优化得到的酒精发酵条件参数准确可靠，模型具有实用价值。

2.3 响应面分析

影响菠萝果酒发酵的各实验因素（温度、pH、初始糖度和接种量）之间的交互作用与响应值（酒精度）之间的关系，如图5～图8所示。

2.3.1 温度与pH的交互作用对发酵酒度的影响 由图5可得，温度与pH的交互作用对发酵酒度的影响显著，曲面呈现良好的拱形，存在最大值。随着发酵温度和pH的增加，发酵酒度随之增加，达到最高点后，又逐渐减小。当pH很低时，温度对酒精度的影响较小，这是因为过高的酸度抑制了酵母菌的活性，影响其生长。

2.3.2 温度与接种量的交互作用对发酵酒度的影响由图6可以看出，温度与接种量的交互作用对发酵酒度的影响显著。当接种量一定时，随着温度升高，酵母细胞活性逐渐增强，酒精生成量不断上升，但当温度升到一定水平时，酵母菌菌体内的蛋白质和酶的抗热性降低，酒精度就会逐渐下降，所以出现酒精度先升高后降低的现象，并且变化趋势比较明显。

2.3.3 pH与初始糖度的交互作用对发酵酒度的影响图7可以看出，pH与初始糖度的交互作用对发酵酒度的影响显著，曲面呈现良好的拱形，存在最大值。随着pH与初始糖的增加，发酵酒度随之增加，达到最高点后，又逐渐减小。

2.3.4 初始糖度与接种量对发酵酒度的影响 由图8可以看出，随着发酵时间的延长，初始糖度与接种量对发酵酒度的影响显著，在接种量一定时，随着初始糖度的增加，发酵酒度也随之增加，达到最高点后，又逐渐减小。这是因为过高的初始糖度在发酵后期会造成较高的渗透压而抑制酵母菌的活性，影响其生长。

2.4 菠萝果酒品质检验

将自制菠萝果酒活性干酵母按以上研究的最佳工艺条件对菠萝果汁进行发酵，得到的菠萝果酒与市售葡萄酒用活性干酵母发酵所得的菠萝果酒进行比较，各项质量指标如表6所示。

由表6可以看出，自制菠萝果酒活性干酵母与市售的葡萄酒用活性干酵母发酵的菠萝果酒酒度在色泽、组织状态等方面没有明显的区别，都呈清亮透明的金黄色，但自制活性干酵母发酵所得的菠萝果酒比市售的葡萄酒用活性干酵母发酵所得的菠萝果酒在风味方面有一定优势，菠萝果香浓郁，风味较好，酒精度也较高，达到8.7%，比市售葡萄酒用活性干酵母发酵所得的菠萝果酒高0.9%。

3 结论

将自制菠萝果酒活性干酵母进行复水活化后应用到菠萝果汁的发酵中，用单因素实验结合响应面法优化其工艺条件。菠萝果酒发酵过程的模型为：Y=8.1+0.2972X1+0.2958X2+0.2625X3+0.1792X4-0.2823X12+0.2813X1X2+0.1188X2X3+0.1938X1X4+0.2063X3X4-0.2823X12-0.3037X22-0.1948X42-0.4948X32；优化得到的最佳发酵工艺条件为：温度33.7℃、pH5.6、初始糖度20.5%、接种量5.5%，在此条件下发酵的菠萝果酒的酒度比葡萄酒用活性干酵母发酵所得的菠萝果酒高，达到8.7%，而且菠萝果香浓郁，风味较好。

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[2]刘畅，刘绍军，刘素稳.菠萝果酒发酵工艺条件的优化[J].食品研究与开发，2012，33（2）：61-64.

[3]匡钰，黄和，王玲.菠萝果酒酵母筛选及发酵性能测试[J].食品科技，2012，37（3）：6-10.

[4]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 12456-1990食品中总酸的测定方法[S].北京：中国标准出版社，1990.

[5]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB-T 15038-2006葡萄酒、果酒通用实验方法[S].北京：中国标准出版社，2006.

[6]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.7-2003食品中总糖的测定[S].北京：中国标准出版社，2003.

[7]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.34-2003食品中亚硫酸盐的测定[S].北京：中国标准出版社，2003.

[8]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.2-2010食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

[9]中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.2-2010食品卫生微生物学检验大肠菌群测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

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[11]谢定，钟海雁，催涛，等.响应面法优化水晶梨果醋发酵工艺条件[J].中国食品学报，2009，9（2）：92-98.

[12]李升升，徐怀德，李钰金，等.响应面法对洋葱酒发酵工艺的优化[J].食品科学，2011，32（6）：135-138.