糙米发芽浸泡过程中臭氧对微生物灭菌效果的影响

马 涛，陈伟玲

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866；2.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

发芽糙米不仅改善了糙米口感，而且使促进人体健康和提高人体免疫力的成分，如γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、谷维素和阿魏酸等超出精白米数倍[1]。发芽糙米虽富含营养，但由于原料本身带菌状况复杂，且在发芽过程中受发芽环境条件影响，发芽过程中极易受到微生物污染。目前常用的方法是在发芽过程中添加次氯酸钠等杀菌剂，这不仅增加了现场操作的困难，而且容易造成环境污染，增加污水排放和设备维护费用，更容易产生药剂残留而带来产品的安全隐患。因此，探索一种既能有效杀灭或控制发芽过程中微生物，又便于操作且对环境影响小，提高产品安全性的技术和方法则成为发芽糙米生产的关键。臭氧杀菌技术就是近年来发展起来的一种非热杀菌技术，具有杀菌能力强、速度快、范围广、安全性好、操作简便、生产成本低等突出特点，已经成为食品安全技术中的一项关键技术[2-3]。本实验以糙米的浸泡温度、臭氧浓度、臭氧作用时间、灭菌率为指标，研究臭氧对糙米发芽浸泡过程中灭菌效果的影响，为糙米发芽过程中微生物污染的控制，消除发芽糙米食品安全隐患奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糙米 辽星1号，中稻股份有限公司；pH=9.0的硼酸缓冲液（6g/100mL）、重蒸苯酚溶、60%乙醇溶液、10%次氯酸钠 济南鸿鑫化工有限公司；GABA分析纯 SIGMA公司。

SK-CFG-10C臭氧发生器 济南三康环保科技有限公司；GDYS-101SC臭氧测定仪 长春吉大小天鹅仪器有限公司；AS1菌落记数仪 杭州迅数科技有限公司；YXQ-LS-75S11立式全自动压力灭菌锅 北京科创百方科技发展有限公司；SW-CJ-1F10超净工作台 苏州苏杰净化设备公司；1245电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH.B11-500电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HH-601A超级恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 糙米浸泡 称取糙米5g，用1∶4的无菌水浸泡[4]，然后分别放到24、27、30、33、36℃恒温培养箱里培养9h。

1.2.2 臭氧处理 打开臭氧发生器，运行20min，使臭氧发生器导气管口的臭氧气体浓度稳定维持在5.0mg/L[5]，在无菌的条件下，把浸泡糙米的小烧杯放在臭氧导气管口下分别处理1、2、3、4、5min。

1.2.3 微生物计数 臭氧处理后采用倾注平板计数法对微生物进行计数，然后再设定不同的臭氧浓度：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mg/L，处理方法同1.2.2，每次实验做3个平行。

1.2.4 灭菌率计算 臭氧的灭菌效果依据微生物的灭菌率来评价，灭菌率的计算公式如下：

式中：N0：原始菌落数；N：处理后的菌落数；N’：空白菌落数。

1.2.5 Box-Behnken实验设计 综合单因素实验结果，以浸泡温度、臭氧浓度、臭氧作用时间3个因素为自变量，以真菌总数的灭菌率为响应值，每个因素取三个水平（-1、0、1），设计中心组合实验，响应面因素水平编码表如表1所示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 浸泡温度对灭菌率的影响 臭氧浓度为5.0mg/L，臭氧作用时间为3min条件下，浸泡温度对微生物灭菌效果的影响见图1。

由图1（a）和图1（b）可以看出，随着浸泡温度的升高，臭氧的氧化能力增强，灭菌率增大，当温度为30℃时，灭菌率最大，随着温度的继续增大，灭菌率反而降低了，是因为臭氧随温度的升高，分解速度加快，因此浸泡温度为30℃时最佳。a图中的36℃时真菌总数下降，是因为温度过高，造成微生物蛋白质变性死亡所导致。

2.1.2 臭氧浓度对灭菌率的影响 浸泡温度为30℃，臭氧作用时间为3min，臭氧浓度对灭菌效果的影响见图2。

图2的（a）与（b）变化趋势相似，随着臭氧浓度的增大，灭菌率呈增加趋势。在臭氧浓度为4.0～5.0mg/L阶段，灭菌率较高，且灭菌率分别达到99.992%和99.973%；但浓度继续增大，灭菌率的增大的幅度很小，分别增长了0.004%和0.009%，因此臭氧浓度为5.0mg/L时灭菌效果最佳。

2.1.3 臭氧作用时间对灭菌率的影响 浸泡温度为30℃，臭氧浓度为5.0mg/L，臭氧作用时间对糙米发芽浸泡过程中微生物灭菌效果的影响见图3。

图3显示，臭氧对真菌总数和酵母菌数的灭菌趋势相似，根据总菌数和灭菌率，可以看出在臭氧作用时间为3min时真菌灭菌率达到99.992%，酵母菌灭菌率达到99.995%，继续增加臭氧的作用时间灭菌率分别增加0.006%和0.005%，根据实验的各方面条件和灭菌效果来看，臭氧作用时间为3min时最佳。

2.2 响应面优化臭氧灭菌条件

2.2.1 响应面实验设计及结果 综合单因素实验结果，以浸泡温度、臭氧浓度、臭氧作用时间3个因素为自变量，以真菌总数的灭菌率为响应值，每个因素取三个水平（－1、0、1），根据Box－Behnken实验设计原理[6－11]，设计中心组合实验，实验设计方案及结果见表2。

利用Design Expert 7.0软件，以浸泡温度、臭氧浓度、臭氧作用时间为响应变量，以灭菌率为响应值对表2数据进行多元二次回归拟合，得到回归模型方程为：

方程中B、C的系数较大，表明臭氧浓度和臭氧作用时间对灭菌率具有显著意义。

回归方程的方差分析结果见表3。由表3可知，回归模型极显著（p=0.0059＜0.01），失拟项不显著（p=0.0629＞0.05），表明回归方程拟合程度良好；决定系数R2=0.9586，说明因变量与自变量之间的线性关系显著。综上所述，使用该模型可以较好的对响应值（灭菌率）进行分析和预测。

表3中，一次项B、C及二次项B2、C2表现为极显著，二次项BC为显著，表明它们对响应值的影响极大。根据表3可以得出，各影响因素的主次顺序为：B（臭氧作用时间）＞C（臭氧浓度）＞A（浸泡温度）。

2.2.2 响应面分析 利用Design Expert 7.0软件对二次回归模型进行规范分析，浸泡温度、臭氧作用时间、臭氧浓度之间交互作用对灭菌率的影响见图4～图6。

由响应面回归分析和回归方程拟合，绘出响应面分析图，见图4～图6。等高线的形状可以反映出因素之间交互效应的强弱[12]，由图4～图6的等高线的形状可以看出，浸泡温度与臭氧作用时间、浸泡温度与臭氧浓度之间的交互作用不显著，曲线较为平缓；臭氧的浓度与作用时间对灭菌率影响的交互作用显著，曲线比较陡，这与回归方程方差分析结果一致。由图4可见，根据回归分析方程在考察的区域内绘制响应面图发生弯曲，说明了因素A、C对Y是非线性的，因素A、C对Y存在二次项。随着浸泡温度和臭氧作用时间的提高，Y值也在增大，当浸泡温度和臭氧作用时间升高到一定程度时，Y值达到最大，浸泡温度和臭氧作用时间继续升高时，Y值又会随之下降，说明两者取某个适中值时，可使Y值达到最大。同理，从图5、图6可以看出，A、B和B、C同样对Y是非线性的，对Y同样存在二次项。因此，可以通过软件优化、模拟得最佳提取条件。

2.2.3 臭氧灭菌最佳条件的确立与检验 由Design软件可求出回归模型极值点，即最佳灭菌条件：得A、B、C的值为：A=30.2766，B=3.71995，C=5.3195，即浸泡温度为30.2766℃，臭氧作用时间为3.71995min，臭氧浓度为5.3195mg/L。为检验响应面的可靠性，在最佳灭菌条件下进行验证实验，考录到实际操作，将最佳条件修正为：浸泡温度为30℃、臭氧作用时间为3.7min、臭氧浓度为5.3mg/L。此条件下进行3次平行实验，臭氧平均灭菌率为99.994%，与预测值接近，说明回归方程能比较真实地模拟各因素对臭氧灭菌率的影响，因此，用该回归模型优化臭氧灭菌条件是可行的。

3 结论

在单因素实验基础上，采用响应面法对臭氧在糙米发芽过程中的灭菌条件进行优化，建立了浸泡温度、臭氧作用时间、臭氧浓度3个因素对灭菌率的二次回归方程模型，经检验，模型准确率有效，可以用该模型分析预测各因素对臭氧灭菌率的影响。通过响应面优化模型确定臭氧灭菌的最佳条件为：浸泡温度30℃、臭氧作用时间3.7min、臭氧浓度5.3mg/L，此条件下臭氧灭菌率可达到99.994%。

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