浓硫酸法制备魔芋葡甘聚糖硫酸酯（K G MS）

熊 波，彭述辉，王志江，林 政，王丽霞，庞 杰，*，姚闽娜

（1.福建农林大学食品科学学院，福建福州 350002；2.广州城市职业学院食品系，广东广州510405；3.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

魔芋葡甘聚糖（KGM）是葡萄糖和甘露糖分子比为1∶1.5或1∶1.6，通过β-1，4糖苷键连接形成的一种高分子多糖[1-3]，具有减肥、降血脂、降血糖等[4-6]功效。然而，由于KGM分子的螺旋结构[7-9]，导致其具有极强的吸水能力，溶于水后极易形成一种高粘度的溶液，使其生物活性得不到充分的利用。为此，越来越多的学者转向KGM衍生物的制备及其生物活性的研究[10-11]，研究发现经过硫酸酯化后的KGM具有抗凝血、抗肿瘤和抑制细菌的生长等多种重要的生理功能，而且其活性与其取代度的大小密切相关[12]。目前常用的硫酸酯化方法：氯磺酸-吡啶法，其取代度较高，生物活性较好[13-14]，然而氯磺酸为化学危害品，对人体毒性较大，因此寻求一种取代度较高而且更为安全的魔芋葡甘聚糖硫酸酯化方法是目前急需解决的问题。为此，本文采用浓硫酸法制备魔芋葡甘聚糖硫酸酯（KGMS），应用傅里叶红外光谱分析酯化前后KGM结构的变化，并对其制备工艺进行了优化，以获取具有较高取代度的KGMS。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

魔芋葡甘聚糖 购自云南昭通市三艾有机魔芋发展有限公司；浓硫酸、正丁醇、硫酸钠、明胶、氯化钡、三氯乙酸、盐酸、硫酸铵等 均为分析纯。

傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；紫外可见-分光光度计 日本Hitachi公司；电子分析天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂；磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备方法 取10mL按一定体积比混合的浓硫酸与正丁醇混合液作为酯化试剂，加入0.125g硫酸铵，搅拌并置于冰水浴中冷却至0℃，然后缓慢加入一定量魔芋粉，于0℃进行硫酸酯化反应，反应结束后，用4mol/L氢氧化钠中和至pH7.0，然后用蒸馏水透析48h，经冷冻干燥后，即得KGMS。

1.2.2 取代度的测定 硫酸基含量测定：硫酸钡比浊法[15]。

式中：DS为取代度；S为硫酸根的质量分数。

1.2.3 红外光谱分析 将制备好的KGMS加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片，然后将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱。

1.2.4 数据统计分析 采用SAS 8.0软件的响应面Box-Behnken实验设计系统，对浓硫酸法制备KGMS的实验结果进行参数优化，并对优化参数进行统计分析。实验因素水平及编码表见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 浓硫酸与正丁醇体积比对KGMS取代度的影响 从图1可以看出，随着浓硫酸与正丁醇体积比的增加，KGMS的取代度迅速增加，当浓硫酸与正丁醇体积比达到3∶1后，随着浓硫酸与正丁醇体积比的进一步增加，KGMS的取代度开始逐渐下降。因此，浓硫酸与正丁醇体积比在3∶1左右会出现取代度的拐点值，该时间点可确定为优化工艺水平的中心点，选取2∶1和4∶1为高低两水平值。

2.1.2 反应时间对KGMS取代度的影响 从图2可以看出，随着反应时间的延长，KGMS的取代度迅速升高；在30min时，酯化取代度达到最高为0.88；随着反应的进一步进行，硫酸酯的取代度逐渐下降。因此，在反应时间30min左右可能出现取代度的拐点值，该时间点可确定为优化工艺水平的中心点，选取反应时间15min和45min为高低水平值。

2.1.3 KGM质量对KGMS取代度的影响 从图3可以看出，KGM质量对KGMS的取代度的影响相对较小，随着KGM质量的增加，KGMS的取代度先逐渐增加，当达到0.6g以后，由于酯化试剂有效浓度的减少，KGMS的取代度开始逐渐减小。可知，在KGM质量为0.6g左右可能出现取代度的拐点值，因此可确定该质量为优化工艺水平的中心点，选取0.5g和0.7g为高低两水平值。

2.2 响应面设计结果与分析

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，选择浓硫酸与正丁醇体积比X1、反应时间X2及KGM质量X33个因素，设计了3因素3水平的响应面分析实验，实验结果见表2。

使用SAS 8.0软件对表2的结果进行处理与分析，得到KGMS取代度的二次拟合回归方程为：

表3为回归分析结果，回归方差分析显著性检验表明，该模型回归极显著（p＜0.01），并且模型复相关系数R2=0.9592，Radj2=0.8858，说明模型与实际拟合较好，可用于KGMS取代度的理论预测。

方差分析的结果还表明：X1、X2项对模型的影响极显著，项对模型的影响也达到了显著水平，但各因素的交互作用的影响都不显著，说明各因素之间的交互作用影响很小。

各因素的F值可以反映出各因素对实验指标的重要性，F值越大，表明对实验指标的影响越大，即越重要。由表3可知，各因素对KGMS取代度的影响程度大小顺序为：X1＞X2＞X3，即浓硫酸与正丁醇体积比＞反应时间＞KGM质量。

2.2.2 工艺条件的验证 根据响应面Box-Behnken系统拟合的回归曲线，分别求3个自变量的一阶偏导，解方程得到浓硫酸法制备KGMS的最佳条件为：浓硫酸与正丁醇体积比为3.22∶1，反应时间为33min，KGM质量为0.59g，回归曲线预测值为0.94。

为了检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件制备KGMS，重复3次测得KGMS的取代分别为：0.89、0.97、0.92，平均值为0.93，与理论预测值十分接近。

2.3 红外光谱分析

从图4可以看出，KGM和KGMS在3431、2957、1632、1383cm-1都有吸收峰，这些是多糖的特征吸收峰，其中3431cm-1处为-OH伸缩振动吸收峰，2957cm-1处为-CH2或CH3的C-H伸缩振动吸收峰，1632cm-1处为C=O的伸缩振动吸收峰，1383cm-1处为C-O的伸缩振动吸收峰。而经过硫酸酯化反应后，KGMS还分别在1257、814cm-1处形成了新的吸收峰，这些都是硫酸酯的特征吸收峰，其中1257cm-1附近的吸收峰是-OSO3-的S=O伸缩振动吸收峰，814cm-1处为C-O-S的伸缩振动吸收峰。这与高三俊等[12]的研究结果是一致的，证明硫酸基已与KGM结合形成KGMS。

3 结论

3.1 本研究采用浓硫酸法对KGM进行硫酸酯化，与氯磺酸-吡啶法相比，所使用的化学试剂毒性较弱，对人体的危害性较小，而且反应较为温和，因此更适于KGMS的生产。

3.2 本研究控制浓硫酸与正丁醇总体积为10mL，通过单因素实验和响应面分析法，对KGMS的制备工艺进行了优化，确定了KGMS的最佳生产工艺条件为：浓硫酸与正丁醇体积比3.22∶1，反应时间33min，KGM的质量0.59g。在此条件下，得到的KGMS取代度平均值为0.93。

[1]Kato K，Matsuda K.Studies on chemical structure of Konjac Mannan[J].Agricultural Biology and Chemistry，1969，33：1446-1453.

[2]Pang J，Sun Y J，Guan YG，et al.Molecular dynamics simulation of glucomannan solution[J].Chinese J Struct Chem，2005，24（7）：841-845.

[3]Chen ZG，Zong MH，Li GJ.Lipase-catalyzed modification of konjac glucomannan[J].J Appl Polym Sci，2006，102：1355-1440.

[4]Bin Li，Jun Xia，Yang Wang，et al.Structure characterization and its antiobesity of ball-milled konjac flour[J].Eur Food Res Technol，2005，221：814-820.

[5]Huang C，Zhang Y，Peng S.The effect of foods containing refined Konjac meal on human lipid metabolism[J].Biomed nviron Sci，1990（3）：99-105.

[6]Vuksan V，Jenkins DJ，Spadafora P.Effects of viscous ietary fiber from Konjac-mannan in subjects with the insulin esistance syndrome[J].Diabetes Care，1999（22）：913-919.

[7]JIAN Wen-Jie，YAO Min-Na，WAN Yi，et al.Study on the Hydration Shell of Single-helical of Konjac Glucomannan[J].Chinese J Struct Chem，2011，30（1）：127-133.

[8]JIAN Wen-Jie，YAO Min-Na，WANG Meng，et al.Formation Mechanism and Stability Study of Konjac Glucomannan Helical Structure[J].Chinese J Struct Chem，2010，29（4）：543-550.

[9]Li B，Xie BJ.Study on molecular chain morphology and chain parameters of konjac glucomannan[J].Acta Pharmaceutia Sinica，2003，38（11）：838-842.

[10]Bing Xia，Wei Ha，Xian-Wei Meng，et al.Preparation and characterization of a poly（ethylene glycol）grafted carboxymethyl konjac glucomannan copolymer[J].Carbohydrate Polymer，2010，79：648-654.

[11]曾晓漫，刘倍毓，钟耕，等.硬脂酸-羧甲基魔芋葡甘聚糖酯的微博法制备工艺及其性能研究[J].食品与发酵工业，2011，37（2）：82-86.

[12]高山峻，侯占伟，吴成东，等.不同分子量磺酰化魔芋葡甘聚糖的制备与生物活性[J].化学与生物工程，2007，24（9）：33-36.

[13]Xiaona Zhao，Yuanliang Hu，Deyun Wang，et al.Optimization of sulfated modification conditions of tremella polysaccharide and effects of modifiers on cellular infectivity of NDV[J].International Journal of Biological Macromolecules，2011，49：44-49.

[14]Xiaoyan Huang，Yuanliang Hu，Xiaona Zhao，et al.Sulfated modification can enhance the adjuvant activity of astragalus polysaccharide for ND vaccine[J].Carbohydrate Polymers，2008，73：303-308.

[15]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1994：91-92.