止痒药物的主要药效学研究方法和观察指标

刘 曼，孙亭方，王贵林 （长江大学医学院，湖北荆州434023）

止痒药物的主要药效学研究是对药物的止痒作用进行实验性评价，目前最常用的评价方法是在瘙痒动物模型上观察单位时间内的瘙痒次数及瘙痒潜伏时间等行为学表现。但瘙痒行为属主观指标，其单独应用难以客观评价药物的止痒效果，常辅以其它指标进行综合评价。现对止痒药物的药效学研究概况作一综述。

1 瘙痒动物模型的建立

该模型的建立旨在探讨瘙痒的病理生理机制和研发止痒药物，目前瘙痒动物模型主要有3类［1］：①特定种系的自发瘙痒动物模型。Matsuda等发现NC／Nga种系小鼠皮损与人类特应性皮炎相一致，它可以作为理想的皮炎动物模型用于相关药物研究；MRL／lpr种系小鼠因具有严重的自身免疫性疾病而自发表现出瘙抓行为，它可以作为模拟人类某些自身免疫性疾病伴发瘙痒症状的理想动物模型。②转基因动物瘙痒模型。该模型在研究瘙痒的发生机制方面应用广泛。③致敏物质诱导的瘙痒动物模型。该模型采用单一炎症介质 （组胺、5－羟色胺、P物质等）或将其配伍组合，通过皮内或皮下注射引发动物的瘙抓动作，观察并记录单位时间的瘙抓次数；也可通过多种途径方式给予化学物质 （如化合物48／80、4－氨基吡啶、右旋糖苷40、二硝基氟苯等）进行致敏，从而引发动物的瘙抓动作。后者在诱发瘙痒的机制和作用效果上优于直接使用外源性炎症介质，且更接近临床，常用于止痒药物的研究。

2 主要观测指标

2.1 单位时间内瘙痒次数

早在1995年日本富山医药大学kuraishi博士研究组就已经制备出小鼠的瘙痒动物模型［2］，该模型采用皮下、皮内或灌胃给药等方式将致痒物质注入实验动物体内，然后观察记录各实验小组小鼠在建模后一段时间的瘙抓行为。Oliveira等［3］分别采用化合物48／80和低分子右旋糖苷40作为致痒剂造模，在颈背侧部位注射化合物48／80，以前、后爪挠鼻子和后爪挠注射部位为瘙痒标准，而注射低分子右旋糖苷40则以除了舔舐动作外瘙抓全身作为一次瘙痒记录。瘙痒次数因选择的致痒剂不同或观测者的主观差异性使得瘙痒的标准难于统一。Jiang等［4］学者在每只实验小鼠后腿皮下植入小磁石，然后放入1个四周环绕着圆形线圈的观察室里观察，利用小鼠瘙抓时后腿动作产生感应电流的原理采用特殊仪器记录，使观测过程更简单、结果更准确，但是对小鼠本身会造成一定伤害。新近发现的SCLABA－Real系统分析方法是一种比较客观简易的无创性记录分析方法，放置在观察笼顶部的高速数字图像采集系统可以同时对4只小鼠的行为进行实时记录分析。实验结束后对药物组、模型组、对照组的瘙痒次数进行统计学处理，可采用单因素方差分析法［3］，此法可以消除多组间比较时的抽样误差。

2.2 瘙抓反应潜伏时间和单次瘙痒持续时间

采用摄像、计时器等仪器分别对药物组和对照组造模后出现瘙痒反应的潜伏时间以及单次瘙抓持续时间进行记录，并进行数据处理分析。这两个指标常结合单位时间内瘙痒次数综合评价受试药物的止痒效果。吴春香等［5］等在研究地肤子醇提取物止痒效果时就使用上述方法和指标。

2.3 致痒剂的致痒阈剂量

采用非定量给予致痒剂的方式造模，以致痒剂使用次数、致痒剂总量等指标作为评价指标，最常采用磷酸组胺诱导的豚鼠瘙痒模型。王雪兰等［6］在研究葎草水提取物止痒作用时先将涂药后的各组豚鼠后肢用细砂纸轻轻擦伤，使之发红，以不出血为度，然后于创面处滴0.25%组胺液，每隔3min滴1次，每次均为0.05ml／只，直至豚鼠出现舔后足为止，将豚鼠首次出现舔右后足时所给予的组胺总量为致痒阈剂量，以各组动物的止痒阈剂量作为评价药物止痒作用的指标。吴春香等［5］采用该研究方法证实地肤子醇提取物的止痒作用；周然等［7］在蛇床子止痒成分R2的一项实验中也采取涂药后于后肢备皮处涂抹磷酸组胺，然后每隔3min以磷酸组胺浓度递增方式给药直至出现豚鼠回头舔后足，并计算磷酸组胺的总量作为致痒阈剂量。

2.4 瘙痒介质的测定

目前有关瘙痒发生的神经生理机制尚未完全阐明，但是国内外在该领域的研究已经取得重大进展。据报道［9］，传导瘙痒的无髓鞘C纤维广泛分布于皮肤真皮与表皮，外源性或内源性因素作用于机体时可产生相应的瘙痒介质，后者与神经末梢上的特异性受体结合而产生痒觉神经冲动。目前已确定的瘙痒介质主要包括胺类、蛋白酶、生长因子、神经肽、类阿片物质、十二烷类细胞素等。瘙痒介质测定是研究药物止痒作用的重要指标。

2.4.1 胺类介质 胺类介质主要有组胺和5－羟色胺，组胺是目前研究最多的瘙痒介质，组胺在体内主要存在于嗜碱性粒细胞和肥大细胞，当细胞受到免疫性和非免疫因素作用时发生脱颗粒释放组胺，后者与游离神经末梢上的受体发生特异结合而引起痒觉传导，但是它并不是所有疾病的瘙痒介质［9］。致痒剂4－氨基吡啶诱发小鼠舔体反应与刺激肥大细胞脱颗粒释放组胺有关［10］，此模型常被应用于药物止痒机制的探讨。周然等［7］用此模型研究蛇床子的止痒作用，采用荧光法测定各组动物皮肤和血清样本的组胺含量，研究结果显示药物组的组胺含量明显低于对照组并有统计学意义，证实了蛇床子止痒有效成分的作用机理可能与其稳定肥大细胞膜、抑制皮肤肥大细胞脱颗粒释放组胺有关。

2.4.2 白细胞介素 业已证实白细胞介素IL－2、IL－4、IL－6能引起瘙痒反应，在转基因鼠中高表达IL－4可引发类似人类特异性皮炎的瘙痒性皮肤病［9，11］。我国学者王晖等［10］采用组胺和4－氨基吡啶联用建立瘙痒动物模型，小鼠眼球取血用试剂盒测定小鼠血清中组胺、INF－γ和IL－6的浓度综合作为评判模型优劣的指标之一，结果表明，瘙痒次数多的实验组血清中上述介质浓度显著高于瘙痒次数少的实验组。巫冠中等［12］在探讨黄酮类活性组分的止痒活性时用氯喹给小鼠全身造模后取各组小鼠血清样本，用免疫组化方法测定IL－4含量，结果证实药物组的IL－4的含量低于模型组，且具有统计学意义。

2.4.3 其它介质 P物质、INF－γ、TNF－α等亦可作为瘙痒介质。P物质是一种含11个氨基酸残基的多聚肽，属于速激肽家族，存在于神经末梢纤维内，与NK－1受体结合而引起痒觉传导。多位学者［13－15］曾报道，在变应性接触性皮炎 （ACD）伴发的瘙痒机制研究中组胺和5－羟色胺可能不起主要作用，P物质通过与神经肽受体结合而发挥生物学效应。在其它类型瘙痒中，C类神经被激活后可导致神经肽P物质的释放，后者加速肥大细胞脱颗粒释放组胺。

2.5 病理形态学检查

在瘙痒动物模型观察瘙痒行为之后，立即剪取模型小鼠注射致痒剂周围2cm×2cm大小面积的皮肤，初步去除皮下结缔组织，放入10%的甲醛溶液中固定保存，然后制成常规病理切片。瘙痒反应的病理学改变主要有：局部毛细血管内皮细胞收缩，毛细血管通透性增加以及炎性成分的渗出，炎性细胞的聚集、增生与浸润。

王晖［10］采用组胺和4－氨基吡啶联用建立瘙痒动物模型，在该模型动物皮肤样本中发现以中性粒细胞为主的炎性细胞分布更密集，间质水肿更明显，结合瘙痒反应次数及致痒介质浓度测定结果综合判断，表明联合方案建立的动物模型瘙痒行为更明显。

巫冠中［12］研黄铜类止痒活性，探讨该药物抑制肥大细胞脱颗粒和组胺释放的作用。选用SD小鼠作为实验动物，经腹腔灌洗收集肥大细胞，并按相应的细胞生物学方法经系列处理得到浓缩的单层细胞液，随机收取100个细胞用1%中性红溶液染色，计数其中脱颗粒的肥大细胞。评判的标准包括细胞边缘的完整性消失；细胞颗粒状物的释放。

3 超敏反应动物模型在止痒药物研究中的应用

超敏反应动物模型的炎症反应程度可用于评价药物止痒效果，在超敏反应动物模型上测定药物组与对照组的局部肿胀度或单位面积重量作为评价指标。周然等［7］将实验组涂药、对照组涂赋形剂后用DNCB（2、4－二硝基氯苯）引发小鼠迟发型超敏反应，各组小鼠以1%DNCB（空白对照组用乙醇）0.1ml均匀涂于脱毛区皮肤致敏，次日起各组背部脱毛区涂抹相应的药物，1次／d，连续5d，于致敏后第5天，各组小鼠以1%DNCB 0.1ml均匀涂于右耳内外两侧以激发，24h后脱臼处死，用打孔器取下两耳相同部位相同面积的耳片称重，以左右耳片重量差值为肿胀度，计算出肿胀率，统计结果表明给药组的肿胀率明显低于对照组。王雪兰［6］亦采用该方法探讨葎草水提取物的止痒效果。

4 小结与展望

止痒药物药理作用在动物实验研究阶段常以瘙痒行为为主要甚至为唯一指标。但在动物瘙痒行为的观察上因瘙痒行为的标准难于统一导致主观上的误差，同时也有客观上的误差，如以小鼠为实验动物对象，小鼠在安静无刺激因素的状态下出现自发性的瘙痒行为动作也较常见［15］。甚至有的学者建立的动物模型本身就不能很好的模拟人类的瘙痒症状［1］，kuraishi经典的瘙痒模型就不能很好的区分疼痛和瘙痒引起的瘙抓动作［16］。我们总结了评价药物止痒效果的常用方法与指标，具体使用时应以瘙痒动物模型的瘙痒行为记录为基础，再联用其它方法与指标。鉴于瘙痒往往是多因素引起的多种瘙痒介质参与的病理症状，有学者在建立瘙痒动物模型时同时采用几种致痒物质建立动物模型而非单一物质制造的动物模型似乎更合理［10］。