人卵泡抑素基因短发夹RNA 表达质粒的构建及其干扰效果的初步鉴定

莫 毅 梁方方 陈月凤 江如兰 叶 健 谢丹尼

1.广西壮族自治区人口和计划生育研究中心(南宁，530021);2.广西壮族自治区畜牧研究所;3.广西壮族自治区医科大学研究生院

卵泡抑素是20世纪80年代中期发现的细胞转化生长因子β超家族(TGF-β)的重要成员，作为卵泡刺激素(FSH)的抑制蛋白，具有抑制垂体促性腺激素的功能［1～3］;通过抑制素(INH)- 激活素(ACT)- 卵泡抑素(FS)调控系统［4，5］，参与卵巢颗粒细胞分化、黄体形成、卵泡闭锁，胚胎发育及胎盘功能等多方面调节［6～9］，在生殖医学中的作用正越来越受到人们的重视。本实验以人FS为靶基因，构建了FS的短发夹RNA(shRNA)重组质粒，并体外瞬时转染至卵巢癌细胞系，以确定其对FS基因干扰效果，为进一步研究FS基因的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Trizol试剂、逆转录酶 M-MLV、Oligo dT-18和脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国 );DNA聚合酶(Taq)、dNTPs、T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和NcoⅠ(Takara，日本);DNA纯化试剂盒和质粒小量提取试剂盒(TIANGEN，中国);DMEM高糖培养液(杭州吉诺，中国);胎牛血清(杭州四季青，中国);1 kb DNA ladder(北京全式金，中国);DH 5a感受态细胞为本研究中心基础实验室保存;pLKO.1载体(北京前景科创生物技术有限公司，中国);3AO人卵巢癌细胞购自上海细胞生物研究所。引物序列由上海生工生物科技有限责任公司合成。

1.2 方法［10］

1.2.1 靶向FS基因的shRNA设计 利用Ambion网站上siRNA设计软件，以GenBank中人FS cDNA序列(NM_006350)为靶序列;结合FS mRNA的二级结构及小分子干扰RNA设计原则，并应用BLAST检索排除其他基因的同源序列;遵循shRNA表达质粒pLKO.1酶切位点要求，设计FS shRNA的引物序列。所选用引物正义链为:5＇- CGGGCTGGGCAGATCTATTGGATTCTCGAGAATCCAATAGAT CTGCCCAGCTTTTTG-3＇，反义链为:5＇-AATTCAAAAAGCTGGGCAGATCTATTGGATTCTCGAGA ATCCAATAGATCTGCCCAGC-3＇。

1.2.2 pLKO.1-FS-shRNA重组质粒的构建 将引物稀释后配置退火反应体系如下:稀释的正反引物各 5.0μl、10 × Oligo退火缓冲液 2.0μl、ddH2O 8.0 μl、总体积 20.0μl。PTC 200(MJ，美国)仪器中退火处理:95℃，5min;70℃，10min。取出反应管，放入70℃水浴锅(关掉水浴锅)使之自然冷却至室温。微型离心机瞬时离心，4℃冰箱保存备用。

pLKO.1载体使用AgeⅠ与EcoRⅠ进行线性化酶切后，使用DNA纯化试剂盒回收线性化载体。然后，将双链Oligos退火聚合物与纯化的线性化pLKO.1载体按照3∶1比例混合，加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜，构建成pLKO.1-FS-shRNA重组质粒。次日转化DH 5a感受态细菌，涂于含有氨苄青霉素的培养板中，37℃过夜培养，第三日挑取3个单克隆菌落摇菌扩增。

1.2.3 重组质粒的鉴定 过夜培养的菌液使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，并通过限制性内切酶NcoⅠ与EcoRⅠ进行双酶切鉴定;酶切验证后的质粒送上海英骏生物技术有限公司测序鉴定。

1.2.4 重组质粒转染3AO人卵巢癌细胞 转染前1天将3AO细胞接种到6cm培养皿中，细胞密度达90%时准备转染重组质粒。采用LipofectamineTM2000转染试剂，按试剂说明书将 pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染人3AO卵巢癌细胞，同时以未转染质粒的3AO细胞为对照。

1.2.5 实时定量反转录PCR初步鉴定重组质粒干扰效果 转染24h后分别收集各组细胞，按Trizol操作说明提取各组细胞总RNA，并使用M-MLV逆转录酶和Oligo dT-18引物逆转录获得cDNA。通过引物设计软件Premier 5.0选择FS及内参β-actin定量引物，并由上海英骏生物技术有限公司合成。FS正向引物序列:5＇-GTGACAATGCCACTTATGCC-3＇;反向引物序列:5＇-GCTGTAGTCCTGGTCTTCATCT-3＇。β-actin引物序列:正向引物:5＇-TGGCACCACACCTTCTACAAT-3＇;反向引物:5＇-AGAGGCGTACAGGGATAGCAC-3＇。引物加入实时定量PCR预混反应体系(SsoFast EvaGreen supermix，Bio-Rad公司，美国)后，退火温度为60℃，40个循环反应扩增。反应结束后数据通过Bio-Rad CFX Manager 2.0软件内的Gene Expression分析模块将两组目的基因和内对照基因表达情况进行比较。

2 结果

2.1 重组质粒的鉴定

使用NcoⅠ和EcoRⅠ对单克隆菌落抽提的质粒进行双酶切，可得到两个条带，分子量分别约为2 000bp和5 000bp，与预计值相符(图1)。将3个经酶切鉴定的阳性克隆送测序，测序结果证实设计序列正确插入载体且无突变。

2.2 重组质粒对FS mRNA干扰效果的初步鉴定

通过实时定量反转录PCR测定FS mRNA水平，结果显示经shRNA干扰后，干扰组细胞中FS基因mRNA表达水平较未转染对照组细胞明显下降，两组目的基因相对于内对照的表达量分别为0.41和1.00，本次设计克隆的FS的shRNA重组质粒转染后对FS mRNA的干扰效率为59%(图2)。

图1 pLKO.1-FS-shRNA重组质粒的酶切鉴定结果

图2 重组质粒转染3AO细胞后FS mRNA的表达

3 讨论

卵巢中FS可通过INH-ACT-FS系统内分泌机制调节垂体FSH的分泌，并且通过旁分泌与自分泌的机制影响卵巢功能、调节卵泡的发育、闭锁和黄体化过程，进而影响女性生殖功能。INH-ACTFS系统异常所致的卵泡膜细胞和颗粒细胞功能失常直接导致卵母细胞成熟障碍［11］。在人类辅助生育技术应用过程中发现，异常高的FS可过度抑制刺激卵泡颗粒细胞增殖分化的FSH合成和分泌，影响卵细胞的生长发育，甚至导致排卵障碍，造成女性不孕［4，9］;血清中过高的FS水平将影响辅助生殖技术过程中外源激素的促排卵作用，并与女性多囊卵巢综合征(PCOS)密切相关［12］。

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象，具有快速、有效、特异性强等优点，已成功用于特定基因的功能研究。而shRNA更是近几年发展起来的一种抑制特定基因表达的新方法，与直接导入siRNA和体外转录的siRNA相比，shRNA表达载体易于扩增，制备成本低;易于通过抗性选择标记构建稳定转染细胞系;便于观察长期抑制特定基因的效果;极低浓度的shRNA就可以引发强大的RNA干扰效应。本文使用pLKO.1慢病毒载体质粒构建了pLKO.1-FS-shRNA重组质粒，测序证实插入片段序列符合设计要求;并使用实时定量反转录PCR证实pLKO.1-FS-shRNA重组质粒瞬时转染入3AO人卵巢癌细胞后可有效干扰3AO细胞内FS基因的表达，干扰效率达59%。此结果为进一步利用构建稳定抑制FS表达的细胞系，深入研究FS对于预测卵巢储备功能和人类辅助生育技术应用结局具有重要意义。

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