植物性杀虫剂对烤烟叶片生理及内在品质的影响

韩富根，康雪莉，王利超，李飞，李丽华，王涵

河南农业大学烟草学院，国家栽培生理生化研究基地，郑州 450002

为了有效减轻害虫为害造成的经济损失，长期以来生产上主要依赖化学合成杀虫剂控制作物害虫，同时亦减弱了农田生态系统的自然控制力量——害虫天敌的作用[1]，某些非选择性化学杀虫剂还具有刺激害虫生殖的效应，导致一些害虫的再猖獗[2]。使用化学杀虫剂对于作物来说也是一种逆境胁迫，对作物的生长生理及产量品质具有诸多负面效应[3]，并且污染环境，危及生态安全。植物性杀虫剂源于植物次生代谢物质，因其具有良好环境相容性而日益受到重视[4]。目前化学杀虫剂在烤烟上的研究则多偏重于围绕合理设置经济阈值，制定害虫防治指标，改善化学合成杀虫剂的剂型和使用方法，延缓害虫的抗药性，提高对害虫的防治效果，减少烟叶农药残留等方面[5-6]。有关化学杀虫剂胁迫下烤烟的生理响应方面的研究尚未见报道。植物性杀虫剂在烤烟上的研究也仅停留在对害虫的防治效果上[7]。碳氮代谢是烤烟最基本的生理代谢过程，与烟叶品质密切相关[8]。为此，笔者在大田条件下，就烟叶生长过程中的碳氮代谢关键酶和保护酶对施用杀虫剂的响应进行了研究，分析了化学合成农药和植物性杀虫剂对烤后烟叶内在品质的影响，为合理使用杀虫剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验处理

试验于2009年在河南农业大学科教园区正常施肥烟田进行，烟苗采用漂浮育苗, 于5月5日移栽,行距1.1 m, 株距0.55 m, 田间管理按优质烤烟生产栽培规范进行。

小区设以下4个处理，CK: 喷施清水；T1：喷施化学杀虫剂；T2：喷施植物性杀虫剂1号；T3：喷施植物性杀虫剂2号。团棵期喷施第一次，现蕾时（打顶第2天，即移栽后70天）喷施第2次，常用化学杀虫剂为10%吡虫啉，有效成分18 g/hm2（河南远见农业科技有限公司）、植物性杀虫剂均稀释500倍液，全株喷雾，以叶面叶背湿透但不滴液为度。植物杀虫剂1号和2号均为本课题组研制的对烟青虫和烟蚜有较好控制效果的专利配方（主要为烟叶、苦参等植物提取组合物）。在每次喷施前都认真清洗器械，以防交叉影响。

分别于移栽后36 d（团棵期）、移栽后69 d(打顶当天）喷施杀虫剂，并于移栽后37 d、53 d、69 d、83 d测定单株叶面积，于移栽后37 d、53 d、69 d、71 d、77 d取中部定位叶（依测定时烟株的叶数而定），用于酶活性的测定。烟叶成熟时按小区采收，并用小型电热烤箱按照三段式烘烤工艺进行调制。

1.2 测定项目与方法

单株叶面积按照国家烟草专卖局烟草农艺性状的调查方法进行测定[9]。取鲜烟叶测定酶活性，硝酸还原酶活性采用活体法[10]，转化酶活性采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[10]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法[11]，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[11]，MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[11]。

各小区烤后烟叶按烤烟42级(国标)分级标准分级，并取中部橘黄三级(C3F)烟叶用于化学成分[12]和致香物质含量检测。

中性致香物质的提取和定性定量：致香物质含量采用 HP5890II一5972 气质联用仪( Agilent 公司)。在同时蒸馏萃取装置的一端接盛有10 g 烟样、1 g 柠檬酸、350 mL 蒸馏水和0.5 mL 内标的500 mL 圆底烧瓶，使用恒温电热套进行加热；装置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷的250 mL 圆底烧瓶，该端烧瓶置于水浴温度为 60℃ 的恒温锅中加热，同时蒸馏萃取 2.5 h 后加入10 g 无水硫酸钠干燥有机相，然后于 60℃ 水浴中浓缩至1 mL 左右。分析样品由GC／MS鉴定结果和NIST库检索定性。GC／MS分析条件：色谱柱：HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气：He；流速：0.8 mL／min；进样口温度：250℃；传输线温度：280℃；离子源温度：177℃；升温程序：初温50℃，恒温2 min 后，以 2℃／min的速度升至120℃，5 min后以 2℃／min 的速度升至 240℃，保持30 min；分流比1:15；进样量2ul ；电离能70 eV；质量数范围25-500 amu；MS谱库NIST02；采用硝基苯内标法定量。

1.3 数据统计分析

数据的方差分析采用SPSS17.0分析。

2 结果与分析

2.1 植物性杀虫剂对烤烟全株叶面积的影响

从表1可以看出，全株叶面积移栽后37 d，T2显著高于T1，二者均显著高于对照和T3；移栽后53 d，T2和T3均显著高于T1，这3个处理均显著低于对照；移栽后69 d，T1和T3均显著低于对照；移栽后83 d，T3显著高于T1，这2个处理均显著低于对照。由此表明，喷施杀虫剂烟株前期（移栽后37 d到53 d)烟叶生长缓慢，尤其化学杀虫剂较慢，移栽后53 d到69 d期间，化学杀虫剂（T1）的烟叶生长明显加快，移栽后69 d到83 d对照和处理烟叶生长均较为稳定。

表1 杀虫剂对烤烟单株叶面积及生长速率的影响

2.2 植物性杀虫剂对烟叶碳氮代谢关键酶活性的影响

2.2.1 对烟叶硝酸还原酶（NR）活性的影响

硝酸还原酶(NR)是高等植物氮素同化的限速酶，其活性反映了植物氮代谢的强度，并直接影响着烟株氮素的同化利用[12-13]。从图1可以看出，烟叶NR活性对照和处理总体变化态势基本一致，均随着喷施杀虫剂后时间的推移呈先升高，当烟株打顶时（移栽后69 d)达到峰值（T2则为移栽后71 d) 而后下降的趋势，烟叶NR活性在各测定时间（移栽后77 d T2略高于对照除外）处理均低于对照，不同处理比较，移栽后53d T1＞T2＞T3,其余各测定时间内均是 T2＞T3＞T1。

图1 杀虫剂对NR活性的影响

2.2.2 对烟叶转化酶（Inv)活性的影响

运转，减少叶绿体中淀粉积累量，使光合碳固定加强[14]。烟叶Inv活性对照和处理随着移栽后时间的推移，均呈M型变化态势（图2）；不同处理比较，移栽后69 d T2＞T1＞T3，移栽后77 d和移栽后83 d均是 T2＞T3＞T1，其余各测定时间均是 T3＞T2＞T1。由此导致全生育期平均烟叶Inv活性T1、T2和T3分别比对照降低22.05%、6.64%和6.84%。

图2 杀虫剂对Inv活性的影响

转化酶（Inv)与碳代谢密切相关，可催化细胞质蔗糖转化形成单糖，从而促进叶绿体内磷酸丙糖向外

2.3 植物性杀虫剂对烟叶保护酶及丙二醛的影响

由表2可知，移栽后53 d（烟株旺长期）烟叶CAT活性处理均高于对照，以T2较高，T3次之，T1较低；移栽后77 d（烟株圆顶期）烟叶CAT活性T2与对照差异不明显，T1显著高于T3，均显著高于对照，而烟叶SOD活性则均是处理高于对照。由此表明，喷施杀虫剂协同增强了烟叶SOD和CAT活性，从而使其烟叶MDA含量不过多积累。

表2 杀虫剂对烤烟保护酶的影响

2.4 植物性杀虫剂对烤烟化学成分的影响

由表3可看出，喷施杀虫剂后总氮、烟碱、还原糖和氯都有所降低，总糖、钾含量有所提高。主要含氮化合物与碳水化合物含量的变化导致了其比值的变化。一般认为：优质烟化学成分品质指标水溶性糖与烟碱的比值接近于10，总氮与烟碱的比值接近于1为佳[15]。从这两者比值来看，喷施杀虫剂的处理均与优质烟叶化学成分指标较为接近，其中植物性杀虫剂烟叶钾素含量较高，尤其植物性杀虫剂1号钾素提高幅度较大。可见喷施植物性杀虫剂1号烟叶化学成分更趋于协调。

表3 杀虫剂对烤烟化学成分的影响

2.5 植物性杀虫剂对烤烟致香成分的影响

经GC／MS对烤后烟叶样品的中性香气成分进行定性定量分析，共检出28种对烟气香味品质影响较大的致香物质（见表4）。不同处理比较，CK烟叶中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚和氧化异佛尔酮2种致香物质含量较高，T1烟叶中脱氢β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮2、糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰基吡咯和苯乙醇6种致香物质含量较高，T3烟叶中6-甲基-5-庚烯-2-酮、巨豆三烯酮3、巨豆三烯酮4、3-羟基-β-二氢大马酮、螺岩兰草酮、糠醇、2-乙酰呋喃、苯乙醛和茄酮9种致香物质含量较高，T2烟叶中其余11种致香物质均较高。烟叶中新植二烯及其以外致香物质含量和致香物质总量以T2较高，T3次之，T1烟叶新植二烯以外致香物质含量较高于对照，但其新植二烯含量较对照降低较多。因而对照烟叶致香物质总量高于T1。

3 讨论

大部分化学农药对作物生长会产生一定的负面影响。冬性植物油菜春化阶段外施15mol/L马拉硫磷推迟油菜抽苔和花芽分化[16]，施用1.0～2.5kg/hm2（有效剂量）氟乐灵大豆出苗后根瘤酶形成及其固氮活动均受到不同程度的抑制[17]，有的甚至有利于作物的生长[18-19]。本研究结果表明，烟株圆顶后（移栽后83d)全株叶面积化学杀虫剂处理比对照减少10.89%，植物性杀虫剂1号和2号分别比对照减少3.66%和7.28%。这说明烟田喷施杀虫剂总体上对烟叶生长产生了一定的不利影响，其中植物性杀虫剂1号的不利影响较小。比较而言，化学杀虫剂处理烟株前期烟叶的生长相对缓慢。这可能与烟株不同时期烟叶的幼嫩程度对不同杀虫剂反应的差异有关。

碳氮代谢是植物最基本的代谢，NR和Inv是植物碳氮代谢过程中的关键酶。目前烟叶NR和Inv对不同条件响应的研究较多[20-22]，而有关烟叶NR和Inv对喷施杀虫剂相应的研究甚少。本研究结果显示，喷施杀虫剂总体上降低了全生育期的烟叶NR和Inv活性，其中植物性杀虫剂1号和2号均较化学杀虫剂的这种降低作用弱，尤其1号较2号相对更弱。

从喷施杀虫剂后各测定时间烟叶NR和Inv活性的关系来看（图1和图2），在同一测定时间喷施杀虫剂的同一个处理烟叶NR活性较对照降幅较大时，烟株自身同时调节其烟叶Inv活性较对照的降幅不至于过低，同样当同一时间喷施杀虫剂的同一个处理烟叶NR活性较对照的降幅小时，烟株自身同时调节其烟叶Inv活性较对照的降幅增大。从烟叶碳氮代谢相关成分来看，杀虫剂处理烟叶主要碳氮化学成分尤其植物性杀虫剂1号更趋于协调，钾素含量也相对较高。这暗示喷施杀虫剂存在有少许伤害有益的超补偿现象[23]。

SOD和CAT是植物体内的保护酶，SOD主要是清除细胞内的活性氧自由基，CAT主要位于线粒体内，在叶片中具有分解光呼吸时产生的过氧化氢，过氧化氢积累过多，会降低CO2的同化效率；MDA是植物细胞膜过氧化的最终产物，可与细胞内的各种成分发生反应，使多种酶和膜系统遭受损伤。本研究结果表明，杀虫剂胁迫引起了烟叶的应激反应，增强了烟叶SOD和CAT酶活性，从而使烟叶MDA含量维持在相对较低的水平，使烟叶细胞免受其伤害，对维持烟叶生理功能具有一定作用。这可能是杀虫剂胁迫下，烟叶得以正常生长发育，主要碳氮化学成分趋于协调的微观生理原因。

表4 杀虫剂对烤烟致香物质含量的影响 （μg/g）

已有的研究结果表明，烟叶碳氮代谢的平衡协调程度直接或间接影响烟叶化学成分的含量和组成比例[8]，这在本研究中也得到了证实。然而有关碳氮代谢与致香物质形成关系的研究还较为缺乏。 本研究检测到的28种烟叶主要香气成分中，对照和各处理烤后烟叶新植二烯的含量均占绝对优势，一般认为新植二烯是在调制过程中由叶绿素降解形成的叶绿素醇脱水产生的[24]，化学杀虫剂烟叶新植二烯含量较对照低可能是由其对烟株较深程度的胁迫影响到叶绿素的合成。喷施植物性杀虫剂烟叶新植二烯含量比对照和化学杀虫剂要高，这可能是植物性杀虫剂处理促进了烟株对氮素的吸收和转化，形成较多叶绿素有关，也可能是植物性杀虫剂处理烟株碳氮代谢平衡得到了优化的同时，缓解了烟株对氮素和钾素吸收的拮抗作用，促进了烟株对钾素的吸收利用有关，钾素含量的提高（表3），有利于叶绿素和致香物质的形成，还可能是植物性杀虫剂处理烟株碳氮代谢协调程度较好，改善了烟叶烘烤特性，有利于烟叶叶绿素的降解有关，或者是这些因素综合作用的结果。由此导致了植物性杀虫剂1号和2号处理的烟叶新植二烯及其以外致香物质含量和致香物质总量均较高，尤其1号相对更高。

4 结论

相对于10%吡虫啉和植物性杀虫剂2号，植物性杀虫剂1号处理全株叶面积、烟叶NR和Inv活性总体上降幅较小，烟株前期（移栽后53d)烟叶脂膜过氧化水平较低，烤后烟叶主要化学成分更趋于协调，致香物质总量增幅较高，是较优的选择。

[1]周琼，梁广文，曾玲,等.植物提取物和常用药剂对蚜茧蜂的存活、羽化和寄生的影响[J].生态学报，2005,25(6): 1357-1361.

[2]吴进才，许峻峰，冯绪猛，等. 稻田常用农药对水稻三个品种生理生化的影响[J]. 中国农业科学，2003,36(5):536-541.

[3]胡国文，郭世杰，李绍石，等. 减少稻田用药的理论依据和实践（一）[J].昆虫知识，1996,33（1）：3-7.

[4]Nordlund D A. Semiochemicals: Their Role in Pest Contro1[M]. New York: John Wiley, 1981.

[5]Link H M, Southern P S, Melton T A, et al. Scouting tobacco in North Carolina [J]. Agric Ext Serv, N.C.State Univ. Pub. AG-400.1989.

[6]陈江华. 中国烟叶学术论文集[C].北京：科学技术文献出版社，2004: 550-553.

[7]刘晓波，杨立本，陈国华，等．三种植物性杀虫剂对烟草码绢金龟生物活性的研究[J]．中国烟草学报，2001，7(4)：33-35．

[8]史宏志，韩锦峰. 烤烟碳氮代谢几个问题的探讨[J]. 烟草科技，1998 (2): 34-36.

[9]国家烟草专卖局．中华人民共和国烟草行业标准YC／T142—1998．烟草农艺性状调查方法[S]．北京：中国标准出版社，1998．

[10]邹琦. 植物生理生化实验指导[M]. 北京:中国农业出版社, 1995: 36-39 .

[11]刘萍，李明军. 植物生理学实验技术[M].北京：科学出版社，2007.

[12]彭丽丽，韩富根，解莹莹，等. 氮用量对烤烟叶片TSNA前体物含量及硝酸还原酶活性的影响[J].2009,7(3)：35-38.

[13]刘卫群，韩锦峰，史宏志，等. 数种烤烟品种中碳氮代谢与酶活性的研究[J]．中国农业大学学报,1998,3(1):22-26.

[14]武雪萍，刘国顺，朱凯，等. 施用有机酸对烟草生理特性及烟叶化学成分的影响[J]. 中国烟草学报，2003，9(6):23-27.

[15] 王瑞新. 烟草化学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003.

[16]韩玉珍，钟昕，谭向杰，等. 马拉硫磷对青萍6746和油菜成花的影响[J]. 北京农业大学学报, 1994, 20(1):5-7.

[17] 辛明远, 张英武, 牛建泽. 氟乐灵对作物影响的研究[J].植物保护学报, 1985, 12(1): 63-68.

[18]Mellors W K, Allegro A, Hsu A N. Effects of carbofuran and water stress on the growth of soybean plants and twospotted spider mite (Acari: Tetranychidae) populations under greenhouse conditions [J]. Environ Entomol, 1984,13: 561-567.

[19] 林舜华, 高雷明, 韩荣庄, 等. 单甲脒农药对大豆-土壤系统的生态影响[J]. 应用与环境生物学报, 1997, 3(2):106-111.

[20]刘卫群，陈良存，甄焕菊，等. 烟叶成熟过程中碳氮代谢关键酶对追施氮肥的响应[J]. 华北农学报，2005,20(3): 74-78.

[21]云菲，刘国顺，史宏志. 光氮互作对烟草气体交换和部分碳氮代谢酶活性及品质的影响[J]. 作物学报，2010,36(3): 508-516.

[22]杨兴有，崔树毅，刘国顺，等. 弱光环境对烟草生长、生理特性和品质的影响[J]. 中国生态农业学报，2008,16(3): 635-639.

[23]李跃强，宣维健，盛承发. 大强度去叶对棉花叶绿素和保护酶系的影响[J]. 生态学报，2006,26（3）：830-836.

[24]赵铭钦，刘金霞，黄永成，等. 烟草质体色素与烟叶品质的关系综述[J]. 中国农学通报，2007,23(7): 135-138.