氨基多糖含量测定方法的研究

● 山西省产品质量监督检验研究院 贾亮 中北大学材料学院 范平

氨基多糖用途十分广泛，食品工业及医药界将其称为“ 第六要素”。其广泛应用于医疗、生物技术、化妆品、水处理、造纸、食品工程等领域。氨基多糖含量的测定也成为重要的课题，现今其测定方法有很多种，如乙酰丙酮法、USP 法、HPLC 衍生化法、紫外分光光度法(UV 法)、硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法等。但都有其各自的特点，找出一种最佳测定氨基多糖的方法具有重要意义。

实验部分

1.实验试剂与药品

实验所需主要试剂如表1所示

表1 实验试剂与药品

2.实验仪器

UV—754 型紫外分光光度计。

3.硫酸苯酚法

（1）实验原理

苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10 mg～100 mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在490 nm 波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。

（2）标准曲线的制备

准确称取对照品100 mg，制成2.00 mg/mL 溶液于50 mL 容量瓶中备用。然后分别准确称量，取上述溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 于50 mL 容量瓶中，加水至刻度（相当于制备0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL、0.24 mg/mL 的浓度），分别吸取上述溶液各2.0 mL，再加苯酚试剂1.0 mL，摇匀，缓慢滴加浓硫酸5 mL，摇匀后放置5 min，置于沸水浴中加热15 min，然后冷却至室温，用分光光度计在490 nm处，水作参比测定各溶液的吸光值。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标、绘制标准曲线，求回归方程。

（3）测定

取样品1 g（试样），称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液2.0 mL……规定执行。

（4）回收率的计算

吸取试品溶液0.5 mL，分别加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，且分别置于25 mL 试管中，补水至2 mL，以下操作按“标准曲线的制备”中加入6%苯酚1.0 mL……规定执行。

4.硫酸蒽酮法

（1）实验原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

（2）标准曲线的制备

精密量取对照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置于25 mL 量瓶中，用蒸馏水定容、摇匀，分别精密量取0.5 mL，加4 mL 浓硫酸，摇匀，5 min后加1 mL 显色剂，摇匀。置于100 ℃水浴加热10 min，取出，速冷至室温后，以0 mL 对照品溶液制备为空白试剂，以600 nm 为测定波长测定各浓度的吸光值。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程。

（3）测定

取样品1 g（试样），称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL 的容量瓶中，加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液0.5 mL……规定执行。

（4）回收率的计算

吸取试品溶液0.5 mL，分别各加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置于25 mL 试管中，补水至2 mL，以下操作按本法“标准曲线的制备”中分别吸取上述溶液0.5 mL……规定执行。

5.乙酰丙酮法

（1）实验原理

氨基葡萄糖在碱性条件下加热，乙酰丙酮将氨基葡萄糖分子2 号碳位上的氨基乙酰化，生成带有吡咯环的N- 乙酰衍生物。该衍生物与对二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈红色，于525 nm 处测定吸光度。其适用范围是氨基糖。

（2）标准曲线的制备

分别精密量取100 mg/mL 标准品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 置于20 mL 比色管中，另取试品溶液5 mL 置于25 mL 比色管中。各加水至5 mL，再另取25 mL 比色管一支，加水5 mL 作为空白。各加乙酰丙酮试剂1.0 mL，摇匀，置沸水浴中准确加热25 min，取出，用冰水浴迅速冷却后，加无醛乙醇3.0 mL，在60 ℃水浴中保温10 min 后，再加对二甲氨基苯甲醛试液1.0 mL，强力振摇，并继续在60 ℃水浴中保温1 h，立即用冷水冷却至室温，用分光光度计在525 nm 处，水作参比测定各溶液的吸光值。计算即得供测试样浓度。以吸光值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程。

（3）测定

取样品1 g（试样），称准至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀释至刻度。以下操作按本法“标准曲线的制备”中各加乙酰丙酮试剂1.0 mL，摇匀……规定执行。

（4）回收率的计算

吸取试品溶液0.5 mL，分别各加入标准葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置于25 mL 试管中，补水至2 mL，以下操作按本法“标准曲线的制备”中各加乙酰丙酮试剂1.0 mL……规定执行。

结果分析与讨论

1.硫酸苯酚法标准曲线

硫酸苯酚法标准曲线如图1所示：

其回归方程为y = 2.4297x + 0.0098，多次测得被测试样的吸光值平均值为0.416，对照曲线得其平均浓度为0.167 mg/mL，其回收率为97.7%。

2.硫酸蒽酮法标准曲线

硫酸蒽酮法标准曲线如图2所示：

其回归线方程为y=4.1037x- 0.0093，多次测得被测试样的平均吸光值为0.765，对照曲线得其平均浓度为0.186 mg/mL，其回收率为96.5%。

3.乙酰丙酮法标准曲线

乙酰丙酮法标准曲线如图3所示：

其回归线方程为y=1.0771x- 0.0011，经多次测得被测试样的平均吸光值为0.176，对照曲线得其平均浓度为0.170 mg/mL，其回收率为95.8%。

4.讨论

（1）对所得数据的讨论

硫酸苯酚法所测得的羟氨基葡聚多糖（钠型）含量最小，乙酰丙酮法所测得的含量居中，而硫酸蒽酮法所测得的含量最大。苯酚硫酸法方法简单、灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160 min 以上。蒽酮- 硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮硫酸法测定结果偏高于苯酚硫酸法。而乙酰丙酮法所测得的结果稳定性较好，显色在10 min～30 min 内，稳定性较好。

（2）试剂的比较

硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法所用的硫酸均为分析纯，如果不用分析纯则空白大。乙酰丙酮法中，要用到无醛乙醇，主要是由于乙酰丙酮是测定甲醛含量的主要试剂，如果乙醇中含有醛基则影响测定结果，但是无醛乙醇的制备需要很长的时间，影响实验的效率。而硫酸苯酚法以及硫酸蒽酮法所用到的试剂都容易制备。蒽酮试剂易氧化、遇水后测定数值波动较大，且几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。硫酸苯酚法的回收率：结果显示平均回收率是97.7%。在3 种实验方法中最高。

（3）试验方法的比较

表2 各种方法的比较

结论

本实验所用的3 种方法中，硫酸蒽酮法所测结果数值偏大，稳定性最差，不是测定氨基多糖含量的最佳方法。而乙酰丙酮法测量数值较为准确，稳定性也比较好，但实验所需的无醛乙醇的制备较为复杂，使得该方法操作繁琐。硫酸苯酚法方法简单、灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160 min以上，是最佳的测定氨基多糖含量的方法。