铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药及传播机制的研究进展

孙青菊，梁冰

解放军401医院检验科，青岛 266071

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是假单胞菌属中最重要的人类致病菌。该菌偏爱潮湿环境，可发现于各种水性溶液中，包括消毒剂、肥皂水、眼药水、软膏、灌洗液、透析液及治疗设备，成为医院中的污染菌。非免疫损害个体的社区获得性PA感染常与水或溶液污染有关，多表现为浅表感染，如毛囊炎。PA作为医院获得性感染的重要病原体，是医院内呼吸道感染的首要致病菌。重症监护室(intensive care unit，ICU)气管插管患者中PA感染尤为严重， 病死率达40%～50%。PA还可导致医院内泌尿道感染、菌血症等。由于其对抗菌药物的耐药性不断增加，临床治疗十分棘手。

β-内酰胺类抗菌药物是含有β-内酰胺环的一大类抗生素，以青霉素类、头孢菌素类为典型代表，还包括碳青霉烯类、氧头孢烯类、单环β-内酰胺类等，其中青霉素和3代头孢菌素及碳青霉烯类、单环β-内酰胺类抗生素曾是临床治疗PA感染的有效药物，但随着超广谱抗生素的广泛和不合理使用，PA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药性逐渐增强。因此，揭示PA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制对临床PA感染的治疗有一定指导作用。本文综述了近年来国内外有关PA对β-内酰胺类抗菌药物耐药及传播机制的研究进展。

1 β-内酰胺酶的产生

分子生物学研究表明，PA在抗生素广泛使用的压力下可激活多种β-内酰胺酶基因，如tem、shv、ampc、oxa、per、ges、imp、vim等，表达产生的各种β-内酰胺酶可水解β-内酰胺类包括碳青酶烯类抗菌药物，从而产生耐药。已有研究表明，产生β-内酰胺酶是PA对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制之一[1-3]。Ambler分类法将β-内酰胺酶分为A、B、C、D 4类。又根据酶分子中氨基酸序列差异，将其主要分为2类：以丝氨酸为活性位点的A、C、D类和以金属锌离子为活性位点的B类[4]。

A类β-内酰胺酶在临床最常见，以TEM、SHV型为代表，能水解青霉素类、头孢菌素类及单环类抗菌药物[5]。杜兆丰等[6]从深圳地区分离到的耐药PA中，TEM型β-内酰胺酶编码基因携带率高达86.1%。

B类β-内酰胺酶以金属酶为代表，又称金属β-内酰胺酶，最大特点是可水解碳青霉烯类抗菌药物[7]。1991年，日本学者在PA中发现了第1种质粒介导的IMP-1型金属β-内酰胺酶，以后世界各地不断发现产VIM 和IMP 型金属β-内酰胺酶的耐药菌株。目前发现的获得性金属酶基因型主要包括VIM、IMP、SIM、GIM和SPM，其中VIM和IMP型最常见。2012年意大利学者在临床分离的PA中发现了一种新的获得性金属酶，命名为FIM-1[8]。金属β-内酰胺酶由质粒或整合子(主要是Ⅰ类整合子)等可移动遗传元件介导，传播能力特别强，可在不同菌种内和菌群间进行传播，在亚洲、欧洲、美洲许多国家均有发现。其对碳青酶烯类抗菌药物高效的水解性及缺乏有效的抑制剂，给临床抗感染治疗带来极大的困扰。Kumar等[9]对临床分离的145株耐碳青酶烯类PA和不动杆菌的研究显示，金属β-内酰胺酶阳性菌株达26.9%，且均表现为多重耐药。李杰等[10]报道，在65株耐亚胺培南PA中IMP阳性菌株达16.9%，产IMP型金属β-内酰胺酶是其耐药的主要机制之一。新德里金属β-内酰胺酶1(New Delhi metallo-beta-lactamase，NDM-1)是一种新命名的金属β-内酰胺酶，2008年首次在1例瑞典患者感染的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现。NDM-1是相对分子质量(Mr)为28 000的单体，能水解几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物[11]。目前发现携带NDM-1的细菌主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，还有鲍曼不动杆菌、摩氏摩根菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌等[12]， PA中未见报道。

C 类β-内酰胺酶以AmpC酶为代表，能水解第1、2、3代头孢菌素和头霉素，对亚胺培南、头孢吡肟敏感，对阿米卡星也有一定的敏感性[13]。AmpC 酶分染色体编码和质粒编码2种。染色体编码的 AmpC 酶具有可诱导性，一般在革兰阴性杆菌中低水平表达，但在β-内酰胺类抗菌药物诱导剂存在时，酶产量显著上升，又称诱导酶[14]。质粒编码的AmpC酶主要出现在一些缺乏染色体编码AmpC酶的细菌中，一般不水解碳青霉烯类抗菌药物。但在细菌外膜蛋白缺失、药物通透性降低时，可对碳青霉烯类抗菌药物耐药。

D类β-内酰胺酶以OXA为代表，对苯唑西林和氯唑西林有高度水解活性。OXA酶具有极大的变异性，主要为OXA-10亚型，不同亚型对青霉素和广谱头孢菌素的水解活性有差异[15]。已有研究发现PA携带多药耐药性基因的状况严重。古旭东等[16]报道，119株PA中有78株同时携带2个或2个以上的耐药基因，占65.5%。由于携带多药耐药性基因，PA具有多重耐药的特性，多重耐药菌株占临床分离株的4%～28.8%[17,18]。最近Kumar等[19]从临床烧伤患者中分离到101株PA，发现同时携带AmpC和金属β-内酰胺酶的菌株达45.5%，11.9%的菌株对3种或3种以上抗菌药物耐药。PA中多种β-内酰胺酶基因的存在使其对临床常用的β-内酰胺类抗菌药物耐药，给临床治疗带来极大的困难。

2 细菌外膜通透性的改变

与革兰阳性菌中β-内酰胺类抗菌药物不受阻碍即可与青霉素结合蛋白靶位结合相比，革兰阴性菌的外膜是药物进入细菌的一道屏障。药物通过膜孔蛋白组成的通道扩散。如果细菌外膜通透性下降，到达菌内的药物浓度降低，细菌就会产生耐药。PA异常低通透性的外膜结构(小分子药物穿透其膜孔蛋白的速率只有一般革兰阴性菌的1%)在耐抗生素中起重要作用[20]。已证明PA外膜非特异性通道蛋白OprF 缺失能引起对β-内酰胺类抗菌药物的耐药，而PA 外膜蛋白中OprD2蛋白能形成碳青霉烯类抗生素特异结合位点，是以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素进入菌体的特异性通道。OprD2蛋白表达减弱或缺失是PA对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制之一[21]。有研究对耐亚胺培南PA的oprD2基因采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，发现77%的耐药菌株oprD2基因缺失[22]。OprD表达减少，导致细菌外膜通透性下降，使亚胺培南和第4代头孢菌素转运减慢，PA对其敏感度降低，反之，则敏感度增加。据报道，美罗培南除经OprD通道外，还可能通过其他外膜通道进入菌体，所以OprD膜孔蛋白缺失主要引起PA对亚胺培南耐药，对环丙沙星、氨曲南等耐药有一定影响，而对美罗培南耐药无影响[23]。oprD2基因突变可导致OprD蛋白表达降低，也能引起PA耐药[24]。颜英俊等[25]在近期研究中发现，耐亚胺培南PA的oprD2基因突变率达92.3%，突变方式有点突变﹑插入突变等，导致OprD茎-环结构与亚胺培南主要结合位点氨基酸发生替换和移码突变，从而使PA对亚胺培南耐药。有研究认为，单纯oprD2基因缺失仅引起PA对亚胺培南低水平耐药，但与其他耐药机制如产β-内酰胺酶、主动外排机制等协同作用时，可使PA对亚胺培南产生明显耐药[10]。

3 生物膜的形成

细菌生物膜(bacterial biofilm)是指细菌黏附于惰性或活性实体表面、繁殖、分化并分泌大量胞外多聚基质从而形成的微菌落聚集体，是细菌相互粘连并将其自身包裹其中形成的膜样物，可逃避机体免疫系统和抗菌药物的杀灭作用，致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制。PA为易形成生物膜的条件致病菌。近年研究发现，细菌生物膜的形成与PA耐药密切相关，是导致医院抗菌治疗失败的重要因素之一[26]。生物膜对抗生素耐药涉及多种机制，主要有以下几种：①生物膜形成后，细菌处于一种非生长状态，对抑制其生长的抗生素不敏感；②生物膜形成一屏障，导致抗菌药物难以渗透；③生物膜减低机体对细菌的免疫力，减弱机体与抗菌药物的协同杀菌作用[27]；④生物膜表面的β-内酰胺酶及其高度可诱导性导致在有诱导作用的抗菌药物存在时酶产量高度增加[28,29]。临床分离的产生物膜PA在大量黏液物质存在下，往往使常规药敏试验难以达到质量要求，导致结果不可靠。

4 主动外排泵表达的变化

主动外排泵广泛存在于革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌中，在多重耐药中起重要作用，是导致PA耐药的重要原因之一。目前在PA中已发现7种外排泵，6种属耐药-生节-分裂(resistance-nodulation-division，RND)类的药物外排泵系统[30]。它们可在天然野生菌株中表达或由于基因突变而诱导表达，从而介导对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、氟喹诺酮类及四环素类抗菌药物的耐药。每一主动外排泵都由3种蛋白即外膜蛋白、内膜蛋白和连接蛋白(又称膜融合蛋白)组成，形成一横贯细菌内膜与外膜的通道，介导抗菌药物的转运和外排。如果主动外排泵蛋白表达增多，药物转运加快，排出增多，菌体内药物难以达到有效浓度，不能很好发挥作用，细菌就会产生耐药。PA有4种外排泵(即MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM)与耐药关系密切。这些外排泵中尤其以MexAB-OprM系统的作用底物范围最广，在耐药形成中起主要作用。MexAB-OprM系统区别于其他泵的主要特点是能转运大量β-内酰胺类抗菌药物。碳青霉烯类药物对多数β-内酰胺酶比较稳定，而PA对碳青霉烯类药物耐药常与主动外排泵过度表达有关[20,31]。刘永芳等[31]报道，在27株耐碳青霉烯类PA中，外排泵高表达菌株占88.9%，其中2种外排泵同时高表达的菌株占25.0%，而3种外排泵同时高表达的菌株高达54.2%。有研究发现，外排泵还与其他耐药机制如细菌的药物作用靶位改变或产β-内酰胺酶等一起发挥明显的协同作用，使细菌耐药率进一步增高[32]。

5 β-内酰胺类抗菌药物结合蛋白的改变

青霉素结合蛋白(penicillin-binding protein，PBP)是位于细菌内膜上的一类微小蛋白质，Mr为30 000～150 000，因其最初发现时能与青霉素共价结合而命名。PBP具有酶催化活性，如高Mr PBP具有糖基转移酶和肽基转移酶活性，低Mr PBP具有羧肽酶活性，参与细菌细胞壁合成、糖肽结构调整和形态维持等功能。PBP是β-内酰胺类抗菌药物的主要作用靶位，不同细菌其种类及含量均不相同。β-内酰胺类药物通过与PBP结合使PBP丧失酶活性，细菌细胞壁无法形成而引起溶菌，从而达到杀灭细菌的作用；若PBP结构或数量发生改变，抗菌药物不能与之结合或亲和力降低，细菌便会产生耐药。对PBP耐药机制研究报道较多的细菌是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌，但临床和实验室均发现耐药PA中有PBP改变的现象存在[33]。每种细菌一般含有多种PBP，PA中有8种不同的PBP，分别为PBP1a、PBP1b、PBP2、PBP3、PBP3a、PBP4、PBP5/6和PBP7，大小不等。高Mr PBP的改变是细菌耐PBP机制的主要因素。但在PA中，低Mr PBP改变可能对细菌耐药性也有影响。PBP2是多种β-内酰胺类抗菌药物的结合位点，有文献报道PA中编码PBP2蛋白的基因pbpA突变使PBP2蛋白表达减少，导致PA对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药[34]。而PBP4结构改变可能与PA对亚胺培南耐药有关[35]。Giske等[36]报道，PA中PBP2和PBP3表达降低可导致PA对碳青霉烯类抗菌药物耐药。有意义的是，有研究发现PA中编码PBP4蛋白的基因dacB失活会导致PA过度表达β-内酰胺酶AmpC[37]。

6 整合子的作用

整合子是具有位点特异性的基因重组系统，在病原菌的基因重组中起重要作用。整合子可识别、捕获并携带耐药基因，使耐药基因在菌种、菌株间水平传播，加快临床上多药耐药性菌株形成。已有研究发现，整合子和转座子可介导细菌各种耐药基因，获得整合子和转座子的细菌可表现为多药耐药性。Ⅰ型整合子是造成PA 耐药传播的重要原因[38,39]。Ⅰ型整合子5′端保守区序列为整合酶基因和启动子序列，3′端保守区序列为耐消毒剂和磺胺基因(qacE△1-sul1)，通过位点特异性基因重组机制使整合酶从周围环境捕获耐药基因，如β-内酰胺酶﹑金属酶，并将其组装在一起，形成耐药基因组合和排列，使细菌具有耐药及多重耐药特性。Ⅰ型整合子常见于临床分离的革兰阴性杆菌。最近姜习新[40]对35株多重耐药PA的耐药基因调查研究发现，Ⅰ型整合子的检出率为31.4%，且Ⅰ型整合子阳性菌株对临床常用抗菌药物，尤其是对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗菌药物的耐药率明显增高；同时该研究发现，Ⅰ型整合子阳性菌株多具有多重耐药特性，并携带2种或3种耐药基因，参与PA多重耐药的形成。

7 结语

综上所述，PA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制非常复杂，传播机制也比较特别。PA具有天然耐药性和获得耐药性，且常是多种机制协同作用的结果，而多种耐药机制导致多重耐药菌株甚至泛耐药菌株的产生，给临床治疗和院内感染控制带来很大困难。随着分子生物学技术的发展和创新，新的抗菌药物相继问世并使用，还将不断有新的耐药机制出现。因此，加强PA对β-内酰胺类抗菌药物耐药及传播机制的研究，对合理使用该类抗生素，有效遏制细菌感染，控制耐药菌株出现有重要意义。

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