T细胞耗竭与慢性病毒感染疾病的研究进展

田晓玲，仇超, 3，徐建青, 3

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海201508; 2. 复旦大学生物医学研究院, 上海 200032；3. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室医学微生物学研究所, 上海 200032

慢性病毒感染后免疫功能紊乱威胁人类健康。机体感染病毒抗原后，抗原特异的初始T细胞(naïve T cell)活化，分化成效应T细胞和记忆T细胞。效应T细胞包括辅助T细胞 (T helper cell，Th细胞)(CD4+T 细胞)和细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)(CD8+T 细胞)。持续病毒感染导致T细胞耗竭。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)感染能持续，是因为大部分病毒特异的抗病毒CTL在发挥杀伤功能后几天内消失，如果病毒没有被清除，就会出现致命的免疫病理现象。急性感染LCMV的小鼠体内病毒能持续感染就是CTL耗竭引起的[1]。

T细胞耗竭代表一种T细胞分化的独特状态，其特征是T细胞逐渐损耗和应答细胞数量缺失。对慢性病原体和肿瘤免疫控制失败的主要原因也可能是T细胞耗竭。细胞功能丢失按等级依次出现，首先丢失的是细胞毒性、增殖能力和白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)产生能力，随后丢失的是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)产生能力[2]。除部分功能丢失，耗竭T细胞中CD43、CD69、抑制受体表达水平升高，效应T细胞相关分子CD62L和CD127表达降低。在慢性病毒感染中，抗原刺激水平和持续时间对耗竭起决定性作用，最严重的耗竭状态是细胞死亡[3]。本文对慢性病毒感染中T细胞耗竭的表型和功能特性进行综述，解释T细胞耗竭的机制，也试图探讨这种T细胞应答在慢性感染中的影响因素，特别是抑制受体表达对T细胞耗竭的影响。

1 对急性和慢性感染的T细胞应答

病毒感染分2种类型，一是急性感染，最后病毒被清除; 二是持续性感染，病毒持续存在。急性感染常形成有效的抗病毒免疫应答，持续性感染进一步分为潜伏性感染、慢性感染和慢发病毒感染3种类型。对于急性病毒感染，CD8+T细胞首先经历增殖期，效应CD8+T细胞累积至能清除病毒；其次是死亡期, 90%～95% 的效应T细胞死亡[2]。仅存活的5%～10%效应CD8+T细胞进一步分化成记忆T细胞群，在缺乏抗原的情况下，这些记忆T细胞能长期存在。记忆CD8+T细胞的产生过程是循序渐进的，抗原刺激引起初始 CD8+T细胞增殖并获得效应功能，包括产生细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力，以及颗粒酶和穿孔素介导的细胞毒性。存活至死亡期后的效应T细胞进一步分化，产生记忆T细胞，记忆T细胞能在没有抗原存在的情况下继续分化，通过内环境的稳定更新获得持续效应功能。一旦再次遇到抗原，记忆T细胞能快速活化并产生效应功能[2,4]。在慢性病毒感染或荷瘤状态下，抗原持续性刺激使T细胞功能和记忆形成发生较大改变，如产生细胞因子的能力、细胞毒性、增殖能力和细胞因子介导的自我更新能力削弱；抑制受体过表达；细胞因子受体表达下调；细胞内信号通路改变。这些改变与相应的抗原特异T细胞效应功能和增殖能力逐步削弱有关，最终影响宿主的保护能力。这种抗原持续性刺激引起的抗原特异性T细胞表型改变和功能紊乱状态常被称为T细胞耗竭[4]。

T细胞耗竭在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染失控中发挥重要作用。遇到HIV抗原后，在共刺激信号存在的情况下，初始T细胞受体识别特异抗原，引起T细胞活化并持续增殖，形成效应细胞和记忆细胞。这些记忆细胞能产生多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2[5]。耗竭的T细胞尤其是HIV特异性效应CD8+T细胞功能削弱，抑制受体如程序性死亡分子1 (programmed death 1，PD-1)、CTL相关抗原4 (CTL-associated antigen 4, CTLA-4)高表达，这些过程对耗竭有重要作用[4]，但对其转录调控机制仍不清楚[6,7]。抗反转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)后或表位逃逸突变或T细胞识别丢失导致HIV特异CD8+T 细胞丢失[8]，如果表位逃逸发生较早，一些记忆T细胞会重新恢复分化[9,10]。

2 慢性感染中耗竭T细胞的特征

2.1 在耗竭过程中T细胞效应功能丢失

Zajac等[11]于1998年鉴定了没有效应功能的病毒特异性耗竭CD8+T细胞。通过分析血清中病毒滴度和脾细胞CTL功能，以及单细胞酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)，发现在慢性LCMV感染中，CD4-/-小鼠CD8+T细胞效应功能丢失，不能清除感染，并失去分泌IFN-γ的能力。这些病毒特异性CD8+T细胞表达活化标记CD69hi、CD44hi、CD62Llo，并在体内增殖，但不能产生抗病毒效应。CD4+T细胞缺陷时，这些无应答特点更显著。慢性感染中，抗病毒CD8+T细胞应答通过不同机制沉默，这取决于病毒表位。当去除LCMV 特异性CD8+T细胞的一种显性表位，如核蛋白396～404特异表位，CD8+T细胞对其他特异显性表位的应答仍存在，如糖蛋白33～41。将溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)掺入小鼠体内发现，在CD4+T细胞帮助下，CD8+T细胞能保持足够的效应，慢性病毒感染最终清除。病毒特异性T细胞的耗竭常表现为部分甚至完全丧失产生IFN-γ、β趋化因子或脱颗粒的能力，耗竭最末阶段是病毒特异性T细胞完全消耗[1,11,12]。较严重的CD8+T细胞耗竭与病毒载量成一定比例，长期持续感染或没有CD4+T细胞帮助都会导致更严重的CD8+T耗竭[5]。

在持续性病毒感染中，T细胞耗竭不仅局限于CD8+T细胞应答，CD4+T细胞也失去效应功能[13-16]。在HIV感染中，病毒特异性CD4+T细胞失去效应功能，出现耗竭现象[5,11,17,18]。在慢性感染中，CD4+T细胞产生IL-21，后者帮助CD8+T细胞产生抗病毒功能。对IL-21受体缺陷(Il-21r-/-) LCMV小鼠的研究表明，IL-21对长期保持CD8+T细胞功能、控制LCMV感染很重要，而IL-21主要由病毒特异性CD4+T细胞产生[19-21]。采用细胞内细胞因子染色和多色流式分析方法发现，HIV特异性CD4+T细胞中抑制受体CTLA-4、PD-1和T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(T cell immunoglobulin mucin 3，TiM-3)高水平表达。与这3个基因在HIV特异性CD4+T细胞中的单独表达相比，3个基因的共表达与HIV载量的相关性更强。另外，体外阻断PD-1/PD-1配体(PD-1 ligand 1, PD-L1)通路与CD28协同刺激，可增强HIV特异性CD4+T细胞的增殖能力。这些结果表明，通过调节一个复杂的共刺激受体网络表达，可更好地控制HIV感染[22]。同时阻断多种抑制受体和信号通路，可能增强HIV特异性CD4+T细胞功能，更好地控制HIV复制。

2.2 慢性感染中耗竭T细胞显示多种抑制受体表达

HIV感染中，CD4+T细胞和CD8+T细胞中抑制受体高水平表达是T细胞耗竭的主要特征之一[5]。在鼠LCMV感染中，耗竭的CD8+T细胞显示7种抑制受体表达，即PD-1、淋巴细胞活化基因3分子(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)、CD160、2B4、CTLA4、人白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员3 (leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 3，PIR-B)和糖蛋白49[17]。

PD-1是B7-CD28家族的免疫调节分子成员[23-25]，PD-1通路在HIV感染的T 细胞功能紊乱和耗竭中发挥重要作用。PD-1 除与HIV感染疾病进展相关外(如与病毒载量成正比，以及与CD4+T细胞计数呈负相关)，其表达水平也在HIV特异性CD8+T细胞中显著上调，并与T细胞耗竭密切相关[23]。HIV 特异性四聚体阳性细胞中PD-1表达与病毒载量呈正相关，与CD4+T细胞计数呈负相关。与EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)或巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)特异性CD8+T 细胞比较，在开始ART后，HIV特异性CD8+T细胞中PD-1表达下降。阻断PD-1/PD-L1通路可显著增强四聚体阳性细胞增殖和HIV特异性产IFN-γ的CD8+T细胞/CD4+T细胞的频率。除PD-1外，其他细胞表面抑制受体也调控T细胞耗竭。病毒特异性CD8+T细胞也有LAG-3、CD244 (2B4)、CD160、TiM-3、CTLA-4 及其他抑制受体的表达。通过同时阻断PD-1通路和LAG-3通路[17]、PD-1/CTLA-4[15]或 PD-1/Tim-3[22]，发现表达在相同耗竭CD8+T细胞中的几种抑制受体的不同组合方式及其表达数目与慢性感染的严重程度有关[17]。

在慢性LCMV感染小鼠的不同组织中，耗竭的CD8+T细胞有广泛的PD-1表达。比较相同小鼠脾脏和血液的CD8+T细胞[26]，发现肝脏、脑、骨髓CD8+T细胞中PD-1较持久地高水平表达。虽然脾脏PD-1表达与IFN-γ、TNF-α的产生相关，但PD-1高水平表达的骨髓来源病毒特异性CD8+T细胞在体外仍能产生抗病毒细胞因子。相反，各组织来源的耗竭CD8+T细胞中，PD-1表达与细胞毒性呈负相关。脾脏中PD-L1高表达，而骨髓抗原呈递细胞中PD-L1表达比较低。体内不同组织微环境选择性地支持表达高水平PD-1的CD8+T细胞持久耗竭，提示在不同组织或解剖位点进行体内PD-1阻断对耗竭CD8+T细胞有不同影响。用表面标记CD27、CD45RO 和CCR7 来区分记忆亚群，发现 PD-1主要表达在中央记忆(central memory，CM)、过渡记忆(transitional memory，TM)和效应记忆(effector memory，EM)CD8+T 细胞[27,28]；CD160主要表达在CM和TM CD8+T细胞。相反，EM和效应CD8+T细胞亚群中2B4表达水平最高。经体外刺激，大部分CD8+T细胞中LAG-3高水平表达，而体内研究揭示LAG-3在CM CD8+T 细胞亚群中高表达[28]。ART降低HIV感染者记忆CD8+T 细胞中抑制受体PD-1、CD160、2B4和 LAG-3表达，体外阻断PD-1和2B4抑制通路可提高HIV特异性CD8+T细胞的增殖能力。因此，多种抑制受体影响HIV特异性CD8+T细胞应答，也预示了一种新的HIV免疫干预的潜在靶点[28]。

3 抑制受体和转录因子对T细胞耗竭的调控

近年来，逆转HIV-1引起T细胞耗竭的研究受到广泛关注。通过PD-1和CTLA-4阻断，协同逆转肝内HIV特异性CD8+T细胞的耗竭[28,29]。Tim-3+PD-1+肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)表现出最严重的耗竭表型，丧失增殖及产生细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力，联合阻断Tim-3和PD-1通路在控制肿瘤生长方面比单独阻断Tim-3或PD-1通路更有效[30]。HIV特异性CD8+T细胞耗竭可用抗体介导阻断PD-1/B7-H1信号通路逆转[31]。体内同时阻断LAG-3和PD-1通路导致T细胞耗竭较大程度逆转和对病毒的控制，但单独阻断其中一种抑制受体没有效果，表明耗竭的CD8+T细胞中存在多种抑制受体的调控，也提示在慢性感染中可根据这种调控作用而采用新的治疗干预手段[32]。因此，慢性感染的严重性与抑制受体的数量和强度有密切关系。

LCMV模型研究发现，B细胞诱导成熟蛋白1 (B-lymphocyte-induced maturation protein 1，Blimp-1)在慢性感染的病毒特异性CD8+T细胞中高表达。虽然Blimp-1高表达促成CD8+T 细胞耗竭，但条件性删除Blimp-1可改变慢性感染中病毒特异性CD8+T 细胞分化，并减少抑制受体表达。Blimp-1删除实验表明， Blimp-1是慢性感染中CD8+T细胞耗竭的转录调节剂，在效应功能与T细胞耗竭之间起平衡作用[33]。PD-1上调人和小鼠耗竭CD8+T细胞中一些基因的表达，包括上调碱性亮氨酸拉链转录因子ATF样蛋白(basic leucine zipper transcription factor, ATF-like，BATF)，这是一种活化蛋白 1(activator protein 1，AP-1)家族转录因子。增强BATF表达足以削弱T细胞增殖和细胞因子分泌，BATF敲除可减少PD-1的抑制作用。体外实验通过沉默慢性病毒血症患者T细胞的BATF，可恢复HIV特异性T细胞功能。因此，抑制受体能引起T细胞耗竭，通过上调一些基因如BATF而抑制T细胞功能，可能为提高HIV感染者的T细胞免疫功能提供新的治疗机会[34]。

4 抑制受体信号调控T细胞的可能机制

抑制受体是否仅通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)和共刺激诱导基因表达，抑制受体信号是否能诱导基因转录还不清楚。抑制受体对T细胞调控的可能机制有以下几种：①抑制受体信号可能阻断来自TCR和共刺激通路的所有信号，导致基因转录终止或一定数量减少。②抑制受体可能选择性阻断一些TCR和共刺激信号，导致基因转录改变。③一种抑制受体可能抑制一种特异的共刺激通路，不影响其他共刺激通路，从而抑制基因转录。④抑制受体信号可能阻断共刺激信号，部分阻断TCR信号，也诱导新基因转录[17]。不同的抑制受体可能调控不同的细胞功能，如PD-1通路似乎影响耗竭CD8+T细胞的存活和增值[24]，而LAG-3通路则相反。CD160可能也影响耗竭CD8+T细胞的功能[17]。

研究表明，抑制受体可能以2种以上的方式削弱T细胞功能，如CTLA-4和CD28竞争共刺激配基[35]。相反，PD-1募集磷酸酶如Src同源结构域2酪氨酸磷酸酶1(Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1，SHP-1)、SHP-2 或Src同源结构域2肌醇磷酸酶(Src homology 2-containing inositol phosphatase，SHIP)到TCR近端的信号复合体，从而削弱其信号[36]。CTLA-4 和 PD-1负调控T细胞活化，阻断CD3/CD28介导的糖代谢上调，靶向于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)，但采用不同的调控机制[37]。CTLA-4介导的Akt磷酸化抑制作用对酶抑制剂冈田酸(okadaic acid)敏感，表明2A型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2A, PP2A)在介导CTLA-4对T细胞活化的抑制中发挥显著作用。相反，PD-1信号通过防止CD28介导的磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)活化来抑制Akt磷酸化。PD-1抑制PI3K/AKT活化的能力取决于胞质尾区免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)，进一步增强了这一区域介导PD-1信号转导的重要性。PD-1 在抑制CD3/CD28诱导的T细胞转录改变中比CTLA-4更有效，它们通过不同的潜在协同机制抑制T细胞活化[37]。抑制受体可能通过削弱信号和基因表达的方式起抑制作用，PD-1通过上调一些基因如BATF抑制T细胞功能，表明抑制受体PD-1不仅通过减少TCR信号抑制T细胞，还通过诱导HIV特异性CD8+T细胞中一些抑制T细胞功能基因的表达削弱T细胞功能[34]。对抑制受体的胞内信号通路及其在不同解剖位点与细胞相互作用中发挥的作用机制，还需进一步研究。

目前对涉及T细胞耗竭分子通路的了解较少，导致T细胞耗竭的机制仍不清楚。CTLA-4也是B7-CD28家族成员之一。在未接受ART时，CTLA-4在HIV特异性CD4+T 细胞中表达上调，但在CD8+T细胞中没有上调。CTLA-4与HIV感染疾病进展呈正相关，与CD4+T细胞产生IL-2以应答病毒抗原的能力呈负相关。大部分HIV特异性CD4+T细胞中 CTLA-4 和其他抑制受体PD-1共表达。体外阻断CTLA-4 增加HIV特异性CD4+T 细胞功能，说明CTLA-4 抑制通路选择性调节HIV特异性CD4+T细胞的功能紊乱，不影响HIV特异性CD8+T细胞，为CD4+T细胞耗竭提供依据，也为HIV感染的治疗提供潜在的免疫治疗靶点[15]。

研究LCMV克隆13感染的小鼠模型持续感染过程中不同类型抗原呈递细胞对CD8+T细胞应答的影响，结果发现：①慢性感染中，持续的抗原呈递直接引起T细胞耗竭；②CTL需直接的抗原-主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)相互作用来清除病毒感染的细胞；③CD8+T细胞与造血和非造血细胞中的抗原持续相互作用，负向影响慢性感染中病毒特异性T细胞应答[38]。

5 T细胞耗竭和治疗性疫苗的使用

控制慢性HIV感染的一个很有前景的策略是应用治疗性疫苗，目的是通过刺激患者的抗病毒免疫应答以减少持续的病毒感染，但这一方法并不尽如人意，因为慢性病毒感染者产生的抗病毒T细胞常在功能上已耗竭，不能对治疗性疫苗作出正确应答。研究表明[39,40]，治疗性疫苗结合阻断抑制性受体能协同增强功能CD8+T细胞应答，提高慢性感染小鼠对病毒的控制，为治疗慢性病毒感染提供了很好的借鉴。去除抑制信号，同时增加刺激信号如IL-2，也可能是一种很有潜力的增强治疗性疫苗抗慢性病毒感染效率的方法。

LAG-3的结构与CD4相似，但其与MHCⅡ的亲和力远高于CD4[41,42]。LAG-3 负调控T细胞增殖，控制记忆T细胞库大小[43]，可能被用来在疫苗接种中增大记忆T细胞库，增强疫苗效力。LAG-3通过调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)依赖和不依赖的方式调控T 细胞内环境的稳定[44]，可能对T细胞耗竭也有一定的调控作用。LAG-3在LCMV特异性CD8+T细胞中表达上调，而LAG-3敲除鼠模型研究发现，与对照小鼠相比，T细胞的效应功能和病毒滴度没有改变，表明在LCMV感染中单独LAG-3对CD8+T 细胞耗竭没有较大影响[45]。另外，耗竭T细胞中CD127、CD122受体表达下调[8,46]。

治疗HIV感染的T细胞疫苗目标是诱导HIV特异记忆细胞形成，发展为长久的免疫保护，使机体再次遇到这类病毒抗原时产生记忆应答，防止再次感染或大大降低疾病的严重性。疫苗引起的T细胞分化表现出表型和功能上的多样性。幼稚CD4+T细胞分化为几种有显著效应功能的Th细胞，从而介导针对不同抗原的免疫保护。初始CD8+T细胞分化为效应细胞，在血液中循环或停留在病毒入侵门户，即在组织(包括黏膜)中，对机体遭遇入侵提供直接保护。相反，CM T细胞驻留在T细胞丰富的淋巴器官，为机体提供前体T细胞库，在遇到抗原时立即快速克隆扩增并分化为记忆细胞[2]。

6 结语

目前很多关于T细胞耗竭的问题仍未解决，如为什么耗竭CD8+T细胞在慢性HIV感染中持续存在？了解抗病毒治疗如何消除持续病毒感染非常有意义。逃逸突变说明T细胞给感染机体的病毒施加一定压力(免疫应答)，可能T细胞耗竭创建了一种病毒感染与机体抗感染的平衡。机体以有限的抗病毒防卫能力去抵御病毒感染和减弱感染造成的免疫病理。是否T细胞耗竭也受多种转录因子调控网络的调控？慢性HIV感染中功能紊乱的CD4+T细胞与CD8+T细胞的潜在感染机制是否相同？关键问题是，T细胞耗竭是否能在体内逆转，从而恢复较高的功能? 是否有普遍、共同的潜在分子机制存在于T细胞耗竭中？这些都需进一步研究。

另一个重要问题是，随着对T细胞耗竭了解越来越多，在分子和转录水平能否利用T细胞耗竭作为预防HIV感染的疫苗策略？如在转录过程中避免耗竭T细胞的转录特征，可能保护机体免受HIV的持续感染。T细胞耗竭的信息如何被整合从而开发HIV感染的治疗性和预防性疫苗具有重要意义。对PD-1通路中信号分子的准确作用和作用机制了解也不够。对于将PD-1、CTLA-4阻断作为免疫治疗的靶点，目前还存在一些问题，如缺乏足够的合适动物模型，缺乏免疫治疗的生物标记，有必要研究如何结合多种抑制受体促进和保持耗竭状态。最适抗原刺激结合阻断抑制分子，使调控性细胞因子失效，将是治疗慢性病毒感染的较好方法。

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