响应面法优化水杨酸比色测定还原糖的研究

朱凯杰 陆国权 张 迟

(浙江农林大学农业与食品科学学院，临安 311300)

DNS比色法即3，5－二硝基水杨酸比色法的测定原理是3，5－二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物——3－氨基－5－硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比[1－2]。因此，可以通过测经比色后的分光光度值来测定还原糖的量，从而间接测定作物中的淀粉含量。现今，由于此方法的实用性和准确性，已被广泛应用，如刘华等[3]对烟草中的淀粉含量的测定，陆国权等[4]对甘薯中的淀粉含量的测定。但是应用过程中存在着各种DNS配方，且测定结果存在较大差异[5－7]。因此，为满足各类作物中淀粉的测定，确定一种既准确又方便、快速、经济的DNS比色法的配方势在必行。

本研究从准确性、实用性、方便性、快速性、经济性、安全性等角度，分析并比较了几种目前常用的DNS配方的实用效果，通过对现有的DNS配方的比较和筛选，确定一种快速准确，经济实用的DNS配方，并通过响应面的方法对此配方进行了优化[8－12]。确定了符合上述要求的最佳配方DNS配方，为各类作物中淀粉还原糖的测定奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

3，5－二硝基水扬酸(简称 DNS)、氢氧化钠(NaOH)、酒石酸钾钠、苯酚:亚硫酸钠:丙三醇:上海试一化学试剂有限公司；0.1%葡萄糖标准溶液(准确称取100 mg分析纯的葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重，用少量蒸馏水溶液后定容至100 mL，冰箱保存使用)；试验所用水为蒸馏水。

1.2 仪器

721－分光光度计:南京凯迪高速分析仪器有限公司；AB104－S标准型分析天平:上海台衡仪器仪表有限公；HK135热恒温水浴锅:杭州韩工科技有限公司；容量瓶、滴定管、量筒、烧杯、棕色瓶:上海卫程科学仪器有限公司；移液枪、1 mL吸嘴:北京华汇通科技发展有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 DNS试剂配方的最优化筛选

配方1:甲液——溶解6.9 g结晶酚于15.2 mL 10%氢氧化钠中，并稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g亚硫酸氢钠。乙液——称取255 g酒石酸钾钠，加到300 mL 10%氢氧化钠中，再加入880 mL 1%3，5－二硝基水杨酸溶液。将甲液与乙液相混合即得黄色试剂；贮于棕色试剂瓶中。在室温下放置7～10 d以后使用。

配方2:称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1 000 mL容量瓶中，加入10%氢氧化钠溶液260 mL，再加入20 mL丙三醇，摇匀，冷却后定容至1 000 mL，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置7 d。

配方3:(1)以称取3，5－二硝基水杨酸(C7H4N2O7)6.3 g，氢氧化钠21.0 g充分溶解于500 mL蒸馏水中(水先煮沸10 min后冷却)；(2)加入酒石酸钾钠(C4H4O6KNa·4H2O)182.0 g，苯酚(在50℃水中融化)5.0 mL，偏重亚硫酸钠(NaS2O5)5.0 g，搅拌至全溶，定容至1 000 mL；(3)充分溶解后盛于棕色瓶中，放置10 d。

配方4:酒石酸钾钠18.2 g，溶于50 mL蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5－二硝基水杨酸0.03 g，NaOH2.1 g，苯酚 0.5 g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100 mL，贮于棕色瓶中，室温保存7 d后使用。

配方 5:将6.3 gDNS和262 mL2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容到1 000 mL，放置于棕色瓶7 d后使用。

按上述5种配方配置后，按照方法进行标准曲线的制备，并做适当修改:取9支大试管，分别加入标准的葡萄糖溶液，加蒸馏水调节体积为2 mL，加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加热5 min，立即用流动冷水冷却，加入21.5 mL的蒸馏水，摇匀。在721－100型分光光度仪上520 nm处，以空白溶液为参比，测定吸光度(注:本试验中每个吸光度值均重复测量3次，取其平均值所得)。绘制标准曲线，得出曲线方程。

待上述5条标准曲线绘制好后，更改葡萄糖的加入量为0.5、0.9、1.3 mL，分别加入5种DNS液，再用上述方法测定吸光光度值，带入各曲线方程，算出测定的葡萄糖值，与标准值相比，计算误差，并分析比较。

1.3.2 DNS试剂配方的优化

针对上述5种配方种，选取一种最佳配方，并对其进行响应面的优化。

测定方法:以4支大试管为一组，其中一支中加2 mL蒸馏水，另3支分别加入标准的葡萄糖溶液1 mL，加蒸馏水为1 mL，在4支试管都加入1.5 mL的DNS溶液，水浴加热5 min，立即用流动冷水冷却，加入21.5 mL的蒸馏水，摇匀。在721－100型分光光度仪上520 nm处，以其中的一支空白溶液为参比，测定吸光度。

1.3.3 新DNS配方的验证试验

按照DNS试剂配方的最优化筛选中的方法对新DNS配方进行验证，即对其进行吸光度测定，绘制标准曲线和曲线方程，观察其符合程度和精确度。

1.3.4 淀粉回收率试验

为检验新DNS配方的准确性，进行淀粉回收率试验。先测纯淀粉回收率。方法是称取0.5 g纯淀粉，用盐酸水解，新DNS配方比色法测定。再测定甘薯加纯淀粉回收率，方法是先称取0.25 g甘薯及0.25 g纯淀粉，混合后用新DNS配方进行盐酸水解－DNS比色法测定。

1.3.5 新DNS配方对甘薯的实际测定结果

为检验其实用性和精确性，用新DNS配方和标准DNS配方对20种甘薯中淀粉含量进行测定、比较和分析。

2 结果与分析

2.1 各种DNS配方的曲线绘制、曲线方程以及各种DNS配方的绝对误差

如图1所示，其中y1＝1.056 3x1＋0.079 4，R12＝0.999 7；y2＝1.536 2x2＋0.069 1，R22＝0.999 8；y3＝1.047 5x3＋0.098 1，R32＝0.999 7；y4＝2.312 1x4＋0.012 7，R42＝0.986 7；y5＝1.124 5x5＋0.096 2，R52＝0.999 7，分别表示曲线y1、y2、y3、y4、y5的曲线方程，R12、R22、R32、R42、R52表示各配方的试验数据与曲线方程之间的吻合程度。R2值越接近1，吻合程度越高，越接近0，则吻合程度越低。

图1 5种DNS配方的吸光度测定结果的曲线图

表1表示各种DNS配方的绝对误差，是指当葡萄糖为0.5、0.9、1.3 mL时分别测定出吸光度，用测量的吸光度后带入各自曲线，重复3次，取其平均值，得出的绝对误差。

由图1和表1可以分析得出:配方4绘制的曲线，曲线方程均不理想，最后的误差也最大，与其余4个配方相差太大，这可能是由于配方4中的3，5－二硝基水杨酸用量过少导致的误差偏大，测定值不精确。而配方1、2、3、5得到的曲线和曲线方程均符合要求，4个配方最后所测的误差也无显著性差异。因此，该4种配方的精密度是符合要求的。但考虑到配方1、3、5较为复杂，所需药品较多，且考虑到它们都要加入剧毒药品苯酚，因此，从实用性、方便性、快速性、经济性、安全性等角度，选择配方2进行响应面优化。

表1 各种DNS配方的绝对误差

2.2 单因素试验

2.2.1 DNS用量的影响

在10%氢氧化钠260 mL，丙三醇用量为20 mL时，研究不同DNS用量对吸光度值的影响，结果见图2。从图2中可以看出，吸光度随DNS用量的增大而逐渐升高，当DNS用量为7 g之后吸光度值升高相对缓慢，从节约能源等方面考虑选择DNS用量为7 g为宜。

图2 DNS用量对吸光度的影响

2.2.2 氢氧化钠用量的影响

在DNS用量为7 g，丙三醇用量为20 mL时，研究不同的10%氢氧化钠用量对吸光度值的影响，结果见图3。从图3中可以看出，吸光度随氢氧化钠用量的增大而逐渐升高，当10%氢氧化钠用量为400 mL之后吸光度值升高相对缓慢，从节约能源等方面考虑选择氢氧化钠用量为400 mL为宜。

图3 氢氧化钠用量对吸光度的影响

2.2.3 丙三醇用量的影响

在DNS用量为7 g，10%氢氧化钠用量为400 mL时，研究不同的丙三醇用量对吸光度值的影响，结果见图4。从图4中可以看出，吸光度与丙三醇用量没有关系，故选择丙三醇用量仍然为20 mL为宜。

图4 丙三醇用量对吸光度的影响

2.2.4 放置时间的影响

在DNS用量为7 g，10%氢氧化钠用量为400 mL时，丙三醇用量为20 mL时，研究不同放置时间对吸光度值的影响，结果见图5。从图5中可以看出，吸光度值随放置时间的增加而逐渐升高，但当放置时间为6 d之后，吸光度值升高相对缓慢，故选择放置时间为6 d为宜。

图5 放置时间对吸光度的影响

2.3 响应面优化试验

根据单因素探索的试验结果，以10%氢氧化钠用量、DNS用量、放置时间3个因素为自变量，吸光度为响应值，采用响应面分析法在三因素五水平上对DNS配方进行优化，以找到最优DNS配方为目的。根据Box－Benhnken的中心组合设计原理，中心组合试验的因子及编码值(表2)。

表2 中心组合试验的因子及编码值

对10%氢氧化钠用量X1、DNS用量X2和放置时间X3各水平进行如下编码:X1＝(Z1－400)/100，X2＝(Z2－7)/1，X3＝(Z3－6)/1，以X1，X2，X3为自变量，以吸光度Y为响应值，中心试验设计及试验结果见表3。

表3 中心试验设计及试验结果

表3中试验1～14为析因试验，15～20为中心试验。20个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复6次，用以估计试验误差。采用Minitab 15统计软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表4。

表4 回归系数显著性分析表

对表4数据进行回归分析，获得吸光度Y对编码自变量10%氢氧化钠用量X1、DNS用量X2和放置时间X3的二次多项回归方程:

Y＝0.565 952＋0.011 658X1＋0.007 911X2＋0.011 525X3－0.005 540X12－0.002 706X22－0.006 258X32－0.003 287X1X2－0.001 137X1X3＋0.003 213X2X3

表5 回归方程各项的方差分析表

回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高。由表4可以看出，方程中X1、X2、X3对响应值的影响为极显著，而平方项X1X1、X3X3为差异显著，其余的均为不显著，表明试验因子对响应值不是简单的线性关系。从表5中可以得出，回归项、线性项、平方项为差异极显著，而交互作用不显著。回归方程也是高度显著的，相关系数R2＝0.005 925/0.006 493＝91.25%。说明响应值(吸光度)的变化有91.25%来源于所选变量，即10%氢氧化钠用量、DNS用量和放置时间。因此，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。根据回归分析结果做出相应的响应曲面图及其等值线图，以确认10%氢氧化钠用量、DNS用量和放置时间三因素对吸光度的影响，结果如图6～图8。

图6 10%氢氧化钠用量与DNS用量对吸光度的响应面和等值线

图7 10%氢氧化钠用量与放置时间对吸光度的响应面和等值线

图8 DNS用量与放置时间对吸光度的响应面和等值线

从图6～图8可以看出，X1和X2的交互作用明显，即10%氢氧化钠用量与DNS用量交互作用明显；而X1与X3，X2与X3交互作用不明显，即10%氢氧化钠用量与放置时间，DNS用量与放置时间交互作用不明显。

2.4 验证试验

对回归方程取一阶偏倒数等于零，整理可得下式。

式(1)、式(2)、式(3)联立方程组，解得X1＝0.261，X2＝2.165，X3＝1.451，代入前述的变换公式得到10%氢氧化钠用量为426.1 mL、DNS用量为9.165 g和放置时间为7.451 d，但考虑到实际操作的便利，将DNS配方修正为10%氢氧化钠用量为426 mL、DNS用量为9.165 g、放置时间为7 d，在修正条件下，实际测得吸光度(均值)为0.612 7，回归模型预测吸光度理论值为0.612 2。实际测定值比理论预测值高0.000 5。

再对其进行吸光度测定，绘制标准曲线和曲线方程，观察其符合程度和精确度，见图9。

图9 优化后DNS配方吸光度测定结果的曲线绘制及曲线方程

由图9可知，其曲线非常理想，R2达到了0.999 9，是符合要求的，且其精密度是相当高的，因此优化后效果显著。

2.5 淀粉回收率试验

为检验新DNS配方的准确性，特作了回收率试验。先测纯淀粉回收率。方法是称取0.5 g纯淀粉，用盐酸水解，新DNS配方比色法测定。结果纯淀粉5次测定的回收率分别为 101.24%、100.41%、100.62%、100.53%，100.41%，平均为100.64%，标准偏差为0.12%。说明纯淀粉回收率符合测定要求。

为测定甘薯加纯淀粉回收率，先称取0.25 g甘薯及0.25 g纯淀粉，混合后用盐酸水解－DNS比色法测定。表6结果表明，盐酸水解－DNS比色法测定淀粉回收率97.66%～101.42%，符合甘薯中淀粉测定所要求的准确度。

表6 甘薯加淀粉回收率

2.6 新DNS配方对甘薯测定结果

用新DNS配方和标准DNS配方对20种甘薯中淀粉含量进行测定和比较，测定结果见表7。

由20个品种测定结果可得:新配方比标准配方测定的结果平均高约2%，说明新配方测定甘薯中淀粉的含量是符合要求的。

表7 20个甘薯品种测定结果/%

3 结论

在单因素试验的基础上，通过Box－Benhnken中心组合响应面分析法，结合淀粉回收试验和20个甘薯品种实际测定结果，确定优化后的最佳DNS配方为:称取9.165 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后加入10%氢氧化钠溶液426 mL，再加入20 mL丙三醇，摇匀，冷却后定容至1 000 mL，贮于棕色试剂瓶中放置7 d后使用。按照此配方制作标准曲线非常理想，其R2达到了0.999 9，符合要求，且实际测定结果，新配方比标配方测定的结果平均高约2%，也是符合要求的。

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