玉米赤霉烯酮饲粮添加蒙脱石对断奶仔猪脾脏和外周血免疫指标的影响

姜淑贞 杨维仁 杨在宾 王淑静 刘法孝 Chi F

（山东农业大学动物科技学院1，泰安 271018）

（Amlan International2，Chicago 60626）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是由镰孢属真菌产生的类雌激素真菌毒素［1］。目前，全世界谷物和饲料普遍受到ZEA的严重污染［2］。在中国，落后的谷物收获条件和油料加工过程加重了ZEA的污染；低质量的玉米和粮食加工副产品，特别是非常规原料的广泛使用，使ZEA等霉菌毒素的污染程度远远超出国外［3］。研究表明，ZEA及其代谢物通过雌激素受体激活雌激素反应基因的转录［4］，引起多种动物的雌激素中毒症，尤其猪表现最敏感［5］。Jiang等［6］研究表明，断奶母猪饲粮中添加 1 mg／kg ZEA表现明显的阴户红肿、生殖器官肿大以及子宫角组织病理变化；相反，断奶公猪饲粮添加1 mg／kg ZEA则导致生殖器官指数显著降低。大量研究证实，ZEA还具有血液毒性［7］、基因毒性［8］和免疫毒性［9］，表明ZEA的毒性作用还可能存在与雌激素受体部位无关的其他毒性效应机制。国内外有关ZEA的研究主要集中在对成年繁殖母猪繁殖性能［10］和雌性断奶仔猪外生殖器官的影响上［11］，对免疫功能影响的研究仅限于体外试验［12］和高剂量 ZEA处理的实验动物［13］。迄今为止，鲜见有关低剂量 ZEA（1 mg／kg）对断奶仔猪免疫毒性剂量效应关系的研究报道。鉴于ZEA的毒性和对动物以及人类健康形成威胁，迫切需要切实可行的方法对污染ZEA的饲料和食品进行脱毒或使毒素失活。本研究旨在以外周血和脾脏为研究对象，研究低剂量ZEA对断奶仔猪脾脏和外周血淋巴细胞增殖率和IL－2产量的影响，同时评定改性蒙脱石对ZEA的脱毒效应，从而初步揭示ZEA的免疫毒性及其可能机制，为养猪生产中脱毒剂的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 玉米赤霉烯酮（ZEA）

以色列 Fermentek（Jerusalem，Israel）公司生产，为色谱纯，纯度保证值为98%。

1.1.2 改性蒙脱石

与普通蒙脱石吸附剂相比，改性产品粒度更细（颗粒直径：29μm；颗粒数：930亿／kg），并经特殊工艺对蒙脱石进行表面活性剂改性处理。

1.2 试验动物与管理

选择（28±1）日龄、平均体重为（8.84±0.21）kg健康的三元（斯格×长×大）杂交断奶仔猪18头，按照体重随机分为3个处理，每个处理6头（公母各半），每个重复1头猪，各处理组间初始体重差异不显著（P＞0.05）。

仔猪采用试验笼（0.48 m2）单独饲养。单体笼使用塑料漏缝地板，安装有乳头饮水器和料槽，仔猪自由采食和饮水。试验开始前对猪舍进行全面清扫、消毒，试验期间每周进行一次猪舍消毒。舍内安装红外保温灯，第1周维持试验笼内温度在30℃左右，第2周将猪舍内环境温度维持在26～28℃左右。猪舍相对湿度为65%。预试期7 d，正试期22 d。试验在沂南金珠园猪场进行。

1.3 基础饲粮与试验设计

试验基础饲粮营养水平参考NRC（1998）推荐标准配制，饲粮组成和营养水平见表1。处理分别为：Contr.＝基础饲粮；ZEA＋CZ0＝基础饲粮＋1 mg／kg ZEA；ZEA＋CZ4＝基础饲粮 ＋1 mg／kg ZEA＋4 g／kg改性蒙脱石。

1.4 试验饲粮的配制、养分含量和毒素水平的测定

1.4.1 玉米赤霉烯酮污染饲粮的配制

将色谱纯度（98%）晶体粉末状ZEA由乙酸乙酯溶解制成溶液，再将含有ZEA的乙酸乙酯溶液喷洒到一定量的滑石粉载体上，并放置过夜使乙酸乙酯挥发，制成1 000 mg／kg的ZEA预混剂，然后用不含毒素的玉米粉进一步将1 000 mg／kg的ZEA预混剂稀释成10 mg／kg的ZEA预混剂，最后按照试验饲粮中ZEA的设计水平，用ZEA预混剂替代配方中的玉米和载体配制成试验饲粮。试验所需饲粮需于试验正式开始前一周一次性配制完成，在试验前和试验结束后分别取样，用以测定常规养分含量以及毒素水平。

1.4.2 饲粮常规养分测定

饲粮常规养分含量按照张丽英［14］的方法进行。粗蛋白用凯氏定氮法；能量用HR－15氧弹式热量计；钙用高锰酸钾滴定法；食盐用硫氰酸铵反滴定法测定；氨基酸用日立835－50氨基酸自动分析仪进行测定。

1.4.3 饲粮毒素测定

饲粮中ZEA、呕吐毒素、黄曲霉毒素和烟曲霉毒素含量委托台湾亚洲谷物检测中心测定。呕吐毒素采用高效液相色谱法（HPLC）测定，ZEA、黄曲霉毒素和烟曲霉毒素采用酶联免疫吸附（ELISA）和荧光法测定。黄曲霉毒素、ZEA、呕吐毒素和烟曲霉毒素的最低检测限为分别为1μg／kg、0.1 mg／kg、0.1 mg／kg和0.25 mg／kg。对照饲粮和试验饲粮中ZEA的含量分别为0和（1.03±0.04）mg／kg，所有饲粮中烟曲霉毒素的含量平均为（1.19±0.06）mg／kg，未检测到黄曲霉毒素和呕吐毒素。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.5 血样的采集、处理与测定

试验结束当天，对仔猪进行空腹采血。使用真空抗凝管（内加K2EDTA）采集耳缘全血15 mL，采血后立即混匀，置于低温保温箱中暂存，采血结束后，血样立即带回实验室测定外周血淋巴细胞增值率和IL－2产量。

1.5.1 外周血淋巴细胞增值率测定

1.5.1.1 外周血淋巴细胞的制备

将全血与D－hanks 1∶1稀释，然后加入到淋巴细胞分离液（Cedarlane Laboratories Limited，Burlington，Canada.）中于2 000 r／min离心 30 min。取中间白细胞部分。用红细胞裂解液裂解红细胞，然后用RPMI－1640（Hyclone，USA）清洗 3次，每次离心5 min（2 000 r／min），用台盼蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），然后将外周血淋巴细胞悬浮于RPMI－1640完全培养液，调整细胞密度到2×106个／mL。

1.5.1.2 淋巴细胞增殖率测定

将上述细胞悬液分加于96孔培养板中，每孔190μL，同时加入 10μL ConA（Sigma，USA）。置于5%CO2培养箱内，37℃下培养72 h。在培养结束前4 h，每孔加入100μL甲基噻唑基四唑盐（MTT，Sigma，USA），继续培养。培养结束后，每孔吸出100μL上清液后，加入100μL二甲基亚砜（DSMO）溶解紫色结晶产物，用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测定OD值。以对照组吸光度值为1，其余试验组吸光度值和对照组相比，得出各组细胞数量相对对照组的百分比。

1.5.2 外周血淋巴细胞IL－2产量的测定

1.5.2.1 IL－2的体外诱生

外周血淋巴细胞的制备过程同1.5.1.1，于48孔细胞培养板每孔加入500μL细胞悬液。将培养板置于5%CO2培养箱中，在37℃下静置培养24 h。培养结束后取出培养板，在超净工作台中无菌收取上清液，－80℃下冻存备检。

1.5.2.2 IL－2诱生活性检测用靶细胞的制备

于24孔培养板每孔加入细胞悬液1 mL和ConA（Sigma，USA）溶液 1 mL，置于 5%CO2培养箱中37℃培养48 h。取出培养板，收集淋巴细胞并用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心（3 000 r／min离心20 min）。用RPMI－1640完全培养液洗涤2次，再用α－甘露糖苷（Sigma，USA）洗涤3次。最后用含α－甘露糖苷的RPMI－1640完全培养液调整靶细胞浓度至8×106个／mL备用。

1.5.2.3 IL－2产量的测定

96孔细胞培养板每孔加入RPMI－1640完全培养液144μL，再加入待测样品6μL（用RPMI－1640完全培养液进行 1∶16稀释），每孔加入靶细胞50μL。每样品设置3个重复孔，并设RPMI－1640完全培养液空白对照。置5%CO2、37℃细胞培养箱培养30 h，培养结束时每孔加入MTT溶液100μL，继续培养4～6 h，每孔吸出上清100μL后加入DMSO 100μL，用酶联免疫检测仪在570 nm波长测定OD值。

1.6 脾脏样品采集、处理和测定

采血结束后，将试验仔猪电击致死后放血，打开胸腔和腹腔，首先对脾脏器官进行肉眼观察，并记录病变情况。无菌剥离脾脏并称重后，快速切取脾脏样品置于事先准备好的D－Hank’s液中，待测定脾淋巴细胞增殖率。

1.6.1 脾脏相对重＝器官重量（g）／活体重量（kg）

1.6.2 脾脏淋巴细胞的制备和测定

脾脏样品置于盛有适量无菌D－Hank’s液的小平皿中，将上面的脂肪等用剪刀剪掉；将脾脏样品换到另一个盛有Hank’s液的小平皿中，将样品剪成小块；用镊子轻轻将之夹起，置于200目细胞筛上研磨过滤，制成单细胞悬液；将单细胞悬液缓慢加入到用淋巴细胞分层液中，2 000 r／min离心30 min；取中间白细胞部分，用Hank’s液洗涤3次，每次离心5 min（2 000 r／min），用台盼蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），然后将脾淋巴细胞悬浮于RPMI－1640完全培养液并调整细胞密度到2×106个／mL。

1.6.3 脾脏淋巴细胞增值率和IL－2产量测定

脾脏淋巴细胞增值率和IL－2产量的测定方法同外周血淋巴细胞增值率、IL－2产量的测定。

1.7 数据统计

试验数据采用 SAS 9.1［15］计，试验数据用平均值±标准误表示，处理间差异采用单因子方差（one－Way ANOVA）分析进行。采用正交多项式比较法对不同改性蒙脱石梯度的处理效应进行一次线性回归分析，用Duncan’s多组极差检验法进行多重比较，显著性水平P＜0.05。

2 结果

2.1 脾脏相对重量

ZEA污染饲粮及添加改性蒙脱石对断奶仔猪脾脏相对重量的影响见表2。与对照组相比，1 mg／kg ZEA处理组脾脏相对重量显著降低（P＜0.05）。与1 mg／kg ZEA处理组相比，饲粮添加4 g／kg改性蒙脱石显著增加仔猪脾脏相对重量（P＜0.05）。

2.2 外周血和脾脏淋巴细胞增殖率

ZEA污染饲粮及添加改性蒙脱石对断奶仔猪外周血和脾脏淋巴细胞增殖率（Lymphocyte proliferation rate，LPR）的影响见表 2。与对照组相比，1 mg／kg ZEA处理显著降低外周血和脾脏LPR（P＜0.05）。与ZEA处理组相比，添加4 g／kg改性蒙脱石显著提高外周血和脾脏LPR（P＜0.05）。

2.3 外周血和脾脏淋巴细胞IL－2产量

ZEA污染饲粮及添加改性蒙脱石对断奶仔猪外周血和脾脏淋巴细胞IL－2产量的影响见表2。与对照组相比，1 mg／kg ZEA处理显著降低外周血和脾脏淋巴细胞IL－2产量（P＜0.05）。与ZEA处理组相比，添加4 g／kg改性蒙脱石使外周血和脾脏IL－2显著增加（P＜0.05）。

表2 ZEA污染饲粮添加改性蒙脱石对断奶仔猪脾脏重、外周血和脾脏淋巴细胞增殖率以及IL－2产量的影响

3 讨论

3.1 玉米赤霉烯酮对仔猪免疫功能的影响

脾脏为动物体内主要的免疫器官，其发育的状态或其与体重的比值（指数）直接影响动物的免疫调节功能。有关ZEA对动物脾脏指数的研究报道很少。Rsell等［16］研究发现，给断奶雌鼠饲喂添加ZEA（10 mg／kg，相当于 1.5 mg／kg／d）饲粮 8周后，没有影响脾脏与体重和脾脏与脑重的比率，也没有观察到脾脏的组织病理学变化。Abbès等［13］以 40 mg／kg BW ZEA饲粮（相当于1 mg ZEA／d）处理小鼠，发现脾脏组织病理学改变。本研究中，仔猪饲粮添加1 mg／kg水平的ZEA显著降低仔猪脾脏器官指数，表明低剂量ZEA（1 mg／kg）可能通过抑制免疫器官的生长降低仔猪免疫功能。

测定淋巴细胞体外增殖是评价细胞免疫功能的一个重要指标，也是检测淋巴细胞功能的常用方法之一。淋巴细胞增殖是机体免疫系统受到外来抗原刺激后产生的正常的保护性生理反应，淋巴细胞转化率的高低反映机体的细胞免疫水平［17］。ZEA、α－ZOL和β－ZOL能够诱导免疫细胞的细胞毒性，研究证实5～10 mol／L的ZEA及其代谢物抑制牛的嗜中性白细胞［18］，抑制丝裂原诱导的B、T淋巴细胞的增殖［19］。即使低浓度的 ZEA（10μmol／L）也能抑制胸腺瘤Jurkat T细胞的增殖，并证实这种抑制作用是由ZEA诱导 T细胞凋亡引起的［20］。体外试验表明，ZEA能抑制植物血凝素刺激的人外周血淋巴细胞增殖，还能抑制刀豆素A和美洲商陆有丝分裂原刺激的B细胞和T细胞形成［12］。本研究采用MTT法揭示了ZEA可降低外周血和脾脏淋巴细胞的增殖，提示ZEA对外周血和脾脏淋巴细胞的增殖具有抑制作用，进而对仔猪淋巴细胞的免疫功能产生一定影响。

IL－2是T细胞增殖、分化必不可少的细胞因子，因此又被称为T细胞生长因子。在体内，产生IL－2的细胞主要是T细胞，但一些前体T细胞和前体B细胞也能产生IL－2。近年来，IL－2常作为分子疫苗佐剂用于增强疫苗的免疫效果，尤其是增强细胞免疫反应。已有研究表明，用编码鼠IL－2的质粒与丙型肝炎病毒核心蛋白DNA疫苗共同免疫小鼠后，可引起CD4＋T细胞的增殖反应。陈创夫等［21］用构建的IL－2与猪瘟病毒E2基因的真核双表达质粒载体免疫小鼠后，发现免疫效果比单表达E2基因的质粒好。α－ZOL（40和80μmol）显著降低胸腺瘤T细胞 IL－2的表达水平［20］。本试验中，1 mg／kg ZEA处理组仔猪外周血和脾脏IL－2显著低于对照组（P＜0.05），由于IL－2是T细胞增殖、分化必不可少的细胞因子，ZEA诱导外周血和脾脏IL－2水平降低可以解释外周血和脾脏淋巴细胞增殖率下降的原因。

3.2 改性蒙脱石对低剂量玉米赤霉烯酮的脱毒效应

本研究中ZEA剂量的选择是根据大量的饲料原料和产品调查结果以及本实验室前期的研究结果确定的［22－23］。虽然在配料时尽力选择优质原料，但试验饲粮中还是检测到了烟曲霉毒素（1.1～1.3 mg／kg），这也充分反映了我国饲料原料霉菌污染的普遍性。尽管不能排除烟曲霉毒素与ZEA协同对仔猪的毒性效应，但是由于本试验饲粮中烟曲霉毒素的水平低于美国粮食农业组织规定的小于10 mg／kg［24］和欧盟关于仔猪饲粮中FUM小于5 mg／kg［25］的最高限量规定，且本试验饲粮中所有处理中烟曲霉毒素水平一致，因此可以认为试验结果的差异是由ZEA和不同水平吸附剂引起的。

蒙脱石吸附剂对黄曲霉毒素有很明显的正效应［26］，主要是由于黄曲霉毒素的β－二羰基基团具有极性，它的分子能够进入蒙脱石层间，与层间可交换性阳离子产生鳌合作用。然而他们对ZEA和DON的作用却差异很大，ZEA和DON极性的降低是影响吸附剂与毒素亲和力的主要原因［27］。因此，用有机阳离子对层状硅酸盐黏土进行化学修饰，增加矿物质表面的疏水性，以改善其对ZEA和DON等非极性毒素的吸收是非常有效的方法。在含有1.3 mg／kg ZEA的饲粮中添加天然黏土吸附剂能有效改善ZEA对仔猪生殖器官产生的有害作用［22］。高剂量ZEA（40 mg／kg BW）饲粮添加 600或 800 mg／kg的水合硅铝酸盐显著改善ZEA诱导的小鼠IgA和IgG的降低水平［13］。但改性蒙脱石吸附剂对ZEA免疫抑制的保护作用文献很少。本研究中添加4 g／kg改性蒙脱石可显著改善1 mg／kg ZEA诱导的免疫抑制作用。这些结果表明，改性蒙脱石吸附剂可能在消化道内与ZEA形成牢固的复合物，从而减少了ZEA在小肠的吸收，但需进一步的试验证实。

4 结论

4.1 饲粮中添加1 mg／kg的ZEA显著降低断奶仔猪脾脏相对重量、外周血和脾脏淋巴细胞增殖率和IL－2产量。

4.2 1 mg／kg的ZEA处理饲粮添加4 g／kg改性蒙脱石吸附剂能够显著改善ZEA诱导的脾脏和外周血淋巴细胞增值率和IL－2的改变。

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