结核分枝杆菌耐酸机制的研究进展

施旭骏，王晴岚，高谦

复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室, 上海 200032

当细菌进入人体后，巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞等吞噬细胞能对细菌进行吞噬，形成吞噬体，并对细菌进行杀伤。这一过程中，吞噬体内的pH值不是一成不变的。相反，它在每一阶段都受到系统及有序的控制，不仅影响吞噬体的成熟过程，还是吞噬体发挥杀菌作用的重要决定因素。

对于许多细菌来说，吞噬体内的酸性环境是极不利于其生存的。为了更好地适应环境，细菌往往具有一定程度的耐酸能力。更重要的是，那些能阻碍吞噬体酸化的细菌往往表现出更强的毒力。耐酸现象在肠道致病菌如大肠埃希菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌中已有广泛研究，因为这些细菌会遇到胃部强酸性(pH 2～3)环境。但对结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是如何在吞噬体或吞噬溶酶体的酸性环境中生存的，目前还知之甚少。因此，进一步阐明吞噬体的酸化机制及细菌耐酸机制将有助于更好地理解细菌的致病性。

本文主要对吞噬体的酸化作用及结核分枝杆菌适应宿主吞噬体内酸性环境的相关机制作一综述。

1 吞噬体的酸化作用

结核分枝杆菌进入人体后，通过表面受体(如Fcγ R和CR3)识别与胞吞作用进入巨噬细胞，并聚集在吞噬体中。在静息的巨噬细胞中，由于吞噬体还没有与溶酶体融合，内部环境为弱酸性，pH值在6.2左右。当巨噬细胞被γ 干扰素(interferon γ ，IFN-γ )激活后，含有结核分枝杆菌的吞噬体逐步与早期内体、晚期内体、溶酶体融合而成熟为吞噬溶酶体。在不断融合、成熟过程中，溶酶体中含有的多种蛋白水解酶被激活，可降解包括细菌在内的大分子物质。同时，吞噬体内环境逐渐酸化，pH值从约6.2降至约5.5，最后至约4.5[1]。研究发现，在结核分枝杆菌与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)共感染患者中，吞噬体不能成熟、酸化，可能是由于其体内IFN-γ 水平较低，不能激活巨噬细胞[2]。由此可见IFN-γ 在酸化过程中是必需的。吞噬体酸化不仅是囊泡融合的结果，还会影响囊泡转运和吞噬体成熟过程。研究发现，吞噬体酸化是聚集包被蛋白I(coatomer protein I，COPI)复合体及募集ADP核糖基化因子6(ADP ribosylation factor 6，ARF6)和细胞附着蛋白(cytohesin)2的必要条件[3]。

参与酸化作用的主要是囊泡ATP酶(vacuolar ATPase，V-ATPase)，它由V0和V1复合体组成。膜内的V1复合体能水解ATP，将产生的能量转移给膜上的V0复合体，后者将质子跨膜转运至吞噬体内[4]。酸化的吞噬体环境不利于细菌生长，它不但能直接影响细菌的生理代谢，而且酸化产生的质子跨膜梯度会影响细菌所必需的营养物质进入吞噬体腔内。此外，酸性环境还为吞噬体内许多水解酶提供了适宜的pH值，发挥最佳活性，且有利于活性氧、活性氮的产生，这些都与酸化起协同抗菌作用[1]。由此可见，吞噬体酸化在宿主防御中起重要作用。

2 结核分枝杆菌的耐酸机制

2.1 抑制吞噬体与溶酶体融合和酸化过程

2.1.1表面效应分子早期吞噬体膜上含有Rab5、早期内吞体抗原1(early endosome antigen 1，EEA1)和磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)等标记。在成熟过程中，这些标记逐渐丢失，转而获得Rab7和溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein，LAMP)等晚期吞噬体和溶酶体标记。含有结核分枝杆菌的吞噬体仍持续含有Rab5，但缺乏Rab7，提示吞噬体成熟受阻[5]。研究证实，Rab5的效应分子EEA1和人空泡分选蛋白34(human vacuolar protein sorting 34，hVPS34)募集受抑制，导致PI3P不能积累[6]。结核分枝杆菌通过一系列效应分子来影响PI3P信号通路，如利用细胞壁脂阿拉伯甘露糖(lipoarabinomannan，LAM)阻止钙流，抑制hVPS34活化，通过SapM水解PI3P等[1]，阻止早期吞噬体向晚期吞噬体和吞噬溶酶体转变，从而避免吞噬体酸化和溶酶体水解酶等对细菌的杀伤作用。

2.1.2 V-ATPase V-ATPase能利用ATP将质子泵入囊泡使其获得酸性环境。研究发现，含有结核分枝杆菌的吞噬体V-ATPase减少甚至为零，导致酸化受限[7]。这也从另一角度证明结核分枝杆菌吞噬体与核内体的融合受限，因为通常认为存在于成熟吞噬体上的V-ATPase来自内体。最近研究发现，结核分枝杆菌分泌蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PtpA)，能结合至V-ATPase的H亚基，妨碍V-ATPase转运和吞噬体酸化[8]，且PtpA使VPS33B去磷酸化，阻止其与V-ATPase相互作用，从而影响吞噬体与溶酶体融合[9]，证明PtpA在抑制吞噬体酸化中起直接作用。

2.1.3碱性物质尿素酶是某些细菌的毒力因子，它不仅能产氨，碱化微环境，抑制溶酶体酶活性及吞噬体与溶酶体的融合，还能为细菌生长提供氮源。结核分枝杆菌能利用尿素酶产生大量氨，但不太可能通过氨直接中和溶酶体内的酸性环境起作用，因为其他一些碱性物质能升高溶酶体内的pH值并促进吞噬体与溶酶体融合[10]。最近研究表明，在静息状态的巨噬细胞中，尿素酶对含有分枝杆菌的吞噬体有一定的碱化作用；但在激活的巨噬细胞中，碱化作用对酸性更强的吞噬溶酶体内环境没有影响[11]。至于是否存在其他酶或碱性物质在结核分枝杆菌耐酸中发挥作用，还有待进一步研究。

2.2 抵抗吞噬体的酸性杀伤作用

2.2.1细胞包膜功能结核分枝杆菌的细胞壁由肽聚糖层构成。共价连接到肽聚糖上的是阿拉伯半乳糖，其胞外末端又与60～90个碳原子长度的分枝菌酸相连。细胞壁外层还存在大量游离脂质。一些糖脂横穿整个质膜，锚定在质膜上并延伸到细胞壁外。这一复杂的细胞包膜结构有效地阻止了质子进入。对一些结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌酸敏感突变株的研究发现，它们大多存在细胞壁功能相关基因的缺陷[12, 13]，且许多细胞壁或脂质合成基因在低pH值下转录活性改变[14, 15]。Vandal等通过筛选10 100株结核分枝杆菌转座子突变株，发现21个耐酸相关基因[13]，有15个基因与细胞膜功能相关。当用柠檬酸磷酸盐缓冲液重新对21株菌株筛查时，只有2株突变株对酸敏感。很可能是以前培养基中的吐温80被水解为油酸，对细菌产生杀伤作用。确认后的2个耐酸相关基因分别是Rv2136c和Rv3671c。前者参与肽聚糖合成，后者是丝氨酸蛋白酶，能修饰细胞壁。这2株转座子突变株在吞噬体内不能维持细胞内pH值。另外，Rv2136c突变株对细胞壁刺激、氧刺激和宿主环境等高度敏感[16]。但随后发现Rv2136c突变株的酸敏感表型不能被回补，且Rv2136c敲除株并不表现为酸敏感和减毒，表明Rv2136c与上述表型并无直接联系，可能由其他未知原因引起[17]。

2.2.2改变代谢途径在正常情况下，结核分枝杆菌一般通过三羧酸循环代谢糖类获得碳源和能量。当其被巨噬细胞吞噬后，结核分枝杆菌可通过乙醛酸旁路代谢脂肪酸，同时降低代谢率以维持其在巨噬细胞中的生存。Fisher等通过体外pH 5.5酸性条件模拟吞噬体内的酸性环境，利用DNA微阵列方法分析结核分枝杆菌的整体基因表达情况[15]。发现在酸刺激15和30 min后，有81个基因表达显著改变，其中改变最大的是几个非核糖体肽合成酶/聚酮合酶(nonribosomal peptide synthetase/ polyketide synthase，NRPS/PKS)。还有很多表达改变的基因参与脂肪酸代谢，如异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase，Icl)基因icl1表达上调，而参与分枝菌酸生物合成的kas/FASII操纵子表达下调。其中异柠檬酸裂解酶是乙醛酸通路的一个关键酶，它能通过乙酰辅酶A(coenzyme A，CoA)中间体将脂肪酸代谢为葡萄糖。因此，icl1基因能在酸性条件下被诱导，表明结核分枝杆菌可能将低pH值作为进入吞噬体的信号，并通过表达脂肪酸代谢相关基因在酸性条件下长期生存。

2.2.3基因调控研究发现，如果干扰吞噬体酸化，被巨噬细胞吞噬的结核分枝杆菌中约80%原本表达上调的基因不再上调[18]。可见酸性环境对结核分枝杆菌来说是一个重要的刺激信号，能引起基因表达改变。结核分枝杆菌中存在多个双组分调控系统，其中PhoP/R调控一系列基因的表达，参与脂质代谢、缺氧应答的调控等，影响细菌的毒力[19]。有趣的是，一些受PhoP调控的基因在酸性刺激下表达也普遍上调，包括脂质代谢相关的lipF、pks2、pks3、pks4，呼吸相关的nark1、Rv2390ch和转录调节子whiB6等[14]。Abramovitch等通过对结核分枝杆菌特有的aprABC基因区域的研究发现，PhoP/R能感受低pH值信号并诱导aprABC表达来适应酸性环境[20]。

分枝杆菌有独特的蛋白分泌系统，其中包括ESX-1，也称Ⅶ型分泌系统。它负责分泌6 kDa早期分泌抗原靶分子(early secretory antigenic target of 6 kDa，ESAT-6)和培养滤过蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)[21]。这2种蛋白以1∶1形成二聚体，与细菌的毒力、致病性密切相关。进一步研究发现，转录因子EspR能调控Rv3616c-Rv3614c表达，后者能增强ESX-1分泌系统的活性[22]。当ESX-1活性高时，EspR也被转运到细胞外，使转录活性降低，从而降低ESX-1分泌系统活性，形成反馈调节。有趣的是，在酸性条件下，ESAT-6与CFP-10解离，且能溶解宿主细胞膜[23]。结核分枝杆菌能从吞噬体中逃逸至细胞质中，提示ESAT-6很有可能在其中发挥作用。

2.2.4其他Saviola等用体内表达启动子诱捕系统(promoter trap system)技术发现，lipF和Rv0834c基因的启动子在pH 4.5时表达上调[24]。随后Richter验证lipF启动子只在酸性条件下表达上调，在其他如高温、氧刺激、缺氧等条件下表达没有改变[25]。LipF编码一种脂肪酶/酯酶，研究人员猜测该酶可能水解巨噬细胞中的脂肪酸或修饰细菌细胞壁。曾有报道结核分枝杆菌的lipF转座子突变株在小鼠肺部生长减毒，但还没有体外实验证实lipF突变株对酸敏感[24]。Rv0834c编码只存在于病原性分枝杆菌中的PE-PGRS蛋白，其功能尚不清楚。

结核分枝杆菌外膜蛋白A(outer membrane protein A ofMycobacteriumtuberculosis，OmpATb)是一种pH依赖的孔形成膜蛋白，只在某些毒力菌株中表达，参与物质转运[26]。OmpATb通道在酸性条件下自动关闭。OmpATb缺失导致某些水溶性小分子物质的渗透性降低，结核分枝杆菌对酸性环境更敏感，在巨噬细胞和小鼠中生长能力受损[27]。最近研究还发现，OmpATb并不具备一般孔蛋白的功能，但ompATb所在的操纵子编码的蛋白与氨快速分泌、中和pH值和分枝杆菌在酸性条件下的生长有关[28]。

镁离子运输蛋白(Mg2+transport protein，MgtC)可能是一种细胞膜上的Mg2+转运体。结核分枝杆菌mgtC突变株在酸性且低镁的培养基中生长受抑制，在巨噬细胞和小鼠中毒力减弱[29]，而且在这种酸性条件下对Mg2+的需求不可被其他二价离子(如Ca2+、Mn2+、Zn2+)等替代[30]。在大肠埃希菌中同样发现一个可能与耐酸相关的MgtC家族[31]。但最近研究发现，MgtC本身并没有摄取或结合Mg2+的功能，可能通过蛋白相互作用发挥调节因子的作用[32]。MgtC在分枝杆菌耐酸中的具体功能有待进一步研究。

研究人员还发现，结核分枝杆菌的耐酸具有氧依赖性。在有氧条件下，分枝杆菌能抵抗弱酸(pH 5.5)环境；在低氧或缺氧条件下，分枝杆菌对酸更敏感。而外源性硝酸盐能作为电子受体，在酸性、缺氧条件下，通过硝酸呼吸作用保护分枝杆菌[33]。

3 结语

综上所述，当结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后，能对吞噬体内的酸性环境作出适应性应答，抑制吞噬体的融合与酸化，且有一定的耐受酸性环境的能力。分枝杆菌的细胞壁及代谢可能在耐酸中发挥重要作用，其分子机制还有待研究。如上述提到的Rv3671c蛋白，有研究在寻找其特异性底物及水解通路，试图用选择性化学抑制剂使其催化部位失活[34]，这样可能改变结核分枝杆菌的细胞壁成分，使其对酸刺激更敏感。同时，结核分枝杆菌在酸刺激下通过调控子(如PhoP/R)引起一系列基因表达的改变，如果药物作用于该调控子，可能造成细菌在宿主体内存活能力下降。此外，细菌对不同刺激条件的反应通路可能存在交叉，其他应激通路的研究或许可为寻找相关的耐酸通路带来提示。通过作用于应激通路中的关键分子，可能引起细菌对环境的适应力下降，更易被清除。因此，更深入了解结核分枝杆菌耐酸机制有助于为药物开发提供新的靶点。

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