TGF-β1及其信号通路对话在肝纤维化中的研究

赵慧慧，吕文良

中国中医科学院广安门医院感染疾病科，北京 100053

各种原因引起的肝细胞变性、坏死及炎症，接着在坏死区出现细胞外基质(ECM)的沉积，初期增生的纤维组织尚未形成假小叶，称为肝纤维化(HF)，为可复性病变。目前公认的HF形成机制是从肝星状细胞(HSC)的瀑布样激活效应开始的。“三步激活模式”于1995年由德国Gressner［1］提出，第一步是前期炎性阶段，第二步是炎性阶段，第三步是炎症后阶段，在炎症后阶段，即使去除原来的肝损伤因素，也足以持续HF形成过程，因此是重要的、可能永存的阶段。在HF的形成过程中，起着重要作用的是细胞因子，他们相互作用，共同构成网络状调控机制。本文就TGF-β1的信号通路及其信号通路间的对话(crosstalk)进行综述。

1 TGF-β1 与肝纤维化

转化生长因子β超家族是一类具有旁分泌、自分泌作用的细胞因子，至少由30多种细胞因子组成，包括多种TGF-β(5种异体)、激活素、抑制素及骨形态发生蛋白等，来源广泛，HSCs、Kupffer细胞、内皮细胞、肝细胞等都可以分泌。其中TGF-β1是细胞和组织中最丰富的TGF-β成员，与HF发生、发展密切相关，除非特指，在很多研究中采用的TGF-β即为TGF-β1分子。有研究［2］显示TGF-β1既可通过促进HSC合成Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白、层黏连蛋白等增加ECM的合成;又可以通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)合成、促进HSCs分泌组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)而减少ECM降解，还在HSCs活化过程中起着重要作用。郑素军等［3］研究表明TGF-β1对大鼠肝星状细胞系HSC-T6显示了促增殖作用，并能促进HF相关胶原的分泌，还可促进肝细胞、肝窦内皮细胞、库弗细胞、淋巴细胞等合成和分泌TGF-β1、EGF等促纤维化细胞因子，进一步激活HSCs，促进ECM分泌。在可调控TGF-β1表达的转基因模型中发现:过度表达TGF-β1一段时间后出现HSCs的活化及ECM沉积;一旦停止表达 TGF-β1，纤维化即可停止发展，甚至逆转［4-5］。

2 TGF-β1 的信号通路

2.1 TGF-β1的信号通路的上游 TGF-β1在所有类型的细胞中均以无活性形式合成和分泌，其激活主要是受其前体潜在相关肽(latency-associated peptide，LAP)调节的［6］。TGF-β1的活化过程是可以逆转的，若活化的TGF-β1重新结合为LAP，则可以使成熟的具有活性的TGF-β1转变为潜伏形式而失去活性［7］。

2.2 TGF-β1的信号通路的下游 TGF-β1激活的信号通路主要有Smads通路和MAPK通路。

2.2.1 Smads通路:TGF-β1/Smads信号转导分两步:①TGF-β1与其受体结合及受体的活化;②Smads蛋白的激活。TGF-β1受体分为 TGF-β1Ⅰ型受体(TβRⅠ)和TGF-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)两种。Smads蛋白家族是现阶段被确认为细胞内唯一的TβRⅠ激酶底物，是TGF-β1由膜受体到核内目标基因信号转导途径的中心环节。根据Smads蛋白在TGF-β家族信号转导中的作用，分为3类:(1)膜受体激活的Smad(R-smad)包括 Smad 1，2，3，5 和 8，R-Smad 的 MH2 域末端有 1个磷酸化序列Ser-Ser-x-Ser(SSXS)，其中Smad 2和3参与TGF-βs活化素信号途径。(2)通用Smad(Cosmad)即Smad 4，其MH1域具有转录激活和核定位功能。(3)抑制性Smad(I-Smad)包括Smad 6、7，为TGF-β/Smad信号通路的抑制分子。I-Smad缺乏MH1区，C端没有SSXS基序，所以不能被受体磷酸化，但可与活化的TβRⅠ牢固结合，阻止R-Smad的磷酸化，从而对该家族信号传递起负调控作用。Smad 7是TGF-β1信号转导抑制分子，可与Smad 2或Smad 3竞争结合TGF-β1型受体或Smad 4，阻断Smad 2或Smad 3被磷酸化及转位至细胞核内，抑制 TGF-β1信号转导［8］。在整个Smads通路中，经过多步的磷酸化反应，核质穿梭运动及蛋白酶体的降解，最终由I-Smad终止反应。TGF-β1/Smads通路中各型Smad分子之间精密协调，共同完成生理及病理状态下TGF-β的生物学效应。TGF-β1与其受体结合后激活Smad 2和Smad 3并磷酸化，其复合物与Smad 4形成异源三聚体复合物易位入核，与DNA结合，通过和转录因子的相互作用调节靶基因表达［9］。Tahashi等［10］在 HF 大鼠模型中发现，急性肝损伤时，TGF-β可快速诱导Smad 7的表达，使HSC内TGF-β/Smad信号转导通路呈平衡状态，不致大量胶原蛋白生成。然而在HSC转化为MFB后，R-smad持续磷酸化，Smad 7表达下调，最终引起ECM大量堆积，这可能是促发HF的原因之一。有研究［11］表明，当Smad 7含量高于Smad 3两倍时，可抑制TGFβ1受体介导的Smad 3磷酸化，进而使 TGF-β1信号传导中断。另外，TGF-β1/Smads信号通路也是血管紧张素Ⅱ、醛固酮等所致器官纤维化的共同通路。

2.2.2 MAPK通路:丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路是激活后向核内转移并作用于核内转录因子的一个蛋白激酶家族，是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号传导系统之一，其通过连接细胞表面受体和细胞内关键调控因子参与基因的表达。它以保守的三级激酶级联形式［12］激活，即 MAPKKK→MAPKK→MAPK激活后，参与细胞的多种生理病理过程。MAPK信号通路家族主要包括细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK)、P38、c-Jun 氨基末端激酶(amino-terminal kinase，NK)/应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，APK)和大丝裂原激活蛋白激酶 ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)。而P38MAPK作为MAPK家族的重要信号通路，在细胞炎症、增殖、应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起着重要作用［13］。研究显示［14］，炎症刺激可激活P38 MAPK，而P38 MAPK也可以通过调节TNF、IL-1和IL-6等致炎因子以及IL-12等抗炎因子的生成来影响生物体内致炎与抗炎因素的平衡，从而决定炎症反应的进程。有研究证实［15-16］，P38 MAPK在多种与缺血缺氧应激有关的血管损伤性疾病中起重要作用，能引起血管内皮生长因子分泌增强、肝内血管增生，从而导致肝窦毛细血管化。α-SMA是活化HSC的特征标志之一，研究发现［17］，用阻断剂 SB203580阻断P38 MAPK可以降低静息HSC的α-SMA蛋白表达，并可调节其细胞周期，改变 HF的进程。P38 MAPK通路的重要下游因子是ATF-2，它可作用于靶基因引起转录响应，Shuman等［18］研究报道ATF可在肝组织中表达，并且其特定碱基被P38 MAPK磷酸化后表现出明显增加的DNA结合和转录活性。

3 TGF-β1信号通路间的对话

TGF-β1是一种高活性、多功能生物信号分子，而这种多功能性是通过各种信号通路间的对话实现的。Sano等［19］报道 ATF-2 是 TGF-β 介导的 MAPK 和Smads两条信号传导途径中的共同靶位。有研究发现［20］，Smad通路及MAPK通路分别独立并可协同的增加HSCⅣ型胶原的基因表达。在HSC转分化的过程中，TGF-β可以通过激活MAPK信号转导通路，并进一步导致Smad 3与Smad 2的连接部位磷酸化，促进Smad 3和Smad 4复合体的形成及转入核内而发挥作用［21］。Bakin 等［22］发现 PI3-K 的抑制剂 LY294002可以阻止 TGF-β1诱导的 Smad 2磷酸化反应、降低Smad 3的活性及终止TGF-β1刺激的Ⅰ胶原基因的转录，表明Smad蛋白也可能是PI3-K通路的一个靶点，Smads和PI3-K在调节TGF-β1介导的Ⅰ型胶原的表达中存在对话。

对于Smad与ERK信号通路间的对话仍存在争议，不同的细胞类型，ERK与Smad信号通路的相互作用存在差异。在平滑肌细胞中，ERK磷酸化可以促进Smad蛋白磷酸化;而在上皮细胞中，ERK磷酸化反而抑制 Smad 蛋白磷酸化［23］。唐静等［24］在 TGF-β1诱导的 HSC中，加入 PD98059阻断 ERK通路后，活化的HSC数量明显减少，且细胞内Smad 2、Smad 3蛋白磷酸化水平下降，提示Smad 2/3是ERK激酶的下游信号分子之一。有实验研究［11］在加入 PD98059处理后，Smad 7 mRNA及Smad 7蛋白水平均明显下降，表明Smad 7不但在TGF-β1/Smad通路中为负性调节元件，而且ERK通路的活化也可进一步促进 TGF-β1诱导的Smad 7高表达。赵辉平等［25］实验发现HF大鼠肝组织α-SMA和ERK磷酸化(p-ERK)蛋白水平显著上调，Ras p21表达水平上调，ERK蛋白表达水平无大变化，TβRⅠ可经Ras/ERK通路促进胶原合成，印证了ERK依赖的R-smad接头域的磷酸化作用增强了Ⅰ型胶原合成，提示ERK和Smads信号之间在胶原产生上存在着协同作用。在研究ERK和Smads信号之间的对话时，需要进一步了解ERK分别对于R-Smad和I-Smad的作用强度，以了解两者在HF共同作用时的机理。

此外，TGF-β1与其他细胞因子的信号通路也存在对话。有研究［26］表明，TGF-β1可剂量相关性地增加HSC表达 PDGF-β受体，从而明显增强 PDGF促进HSC增殖的作用。对于TGF-β1与上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchyme transition，EMT)之间的对话存在争议，Zeisberg 等［27］发现 TGF-β1 可以促进 EMT，促进肝纤维化。但Scholten等［28］对此提出异议，他质疑Zeisberg等试验检测物质及试验检测方法欠准确，经改进后，他的转基因鼠试验发现不论用TGF-β1还是CCl4诱导HF，都不能证明肝细胞发生了EMT。然而国内李婷芬等［29］证明了肝细胞 HL7702经过 TGF-β1诱导后确实发生了 EMT，肝细胞失去了上皮化特性和功能，具有间质化细胞的特性和分泌胶原的功能。Kaimori等［30］发现用 Smad 4-siRNA干扰小鼠肝细胞后，抑制了 TGF-β1诱导EMT和Ⅰ型胶原的表达，且依然保留上皮化表型和功能，说明TGF-β1/Smads信号通路是EMT发生的重要信号通路。那么进行Smad 4-siRNA干扰之后，肝细胞是否会发生 EMT仍有待于进一步研究。

由于TGF-β1具有多功能性，完全阻断可能会产生严重的副作用［31］。为减少其可能产生的不良反应，选择恰当的治疗靶标成了必要解决的问题。大量研究表明，Smad 3是介导 TGF-β1诱导HF的关键分子。郑素军等［3］发现将Smad 3 siRNA放入慢病毒感染大鼠肝星状细胞系 HSC-T6细胞，Smad 3 mRNA表达受到明显抑制，间接抑制了TGF-β1对HSC-T6的活化，显示了抗HF作用。Schnabl等［32］研究发现在Smad 3基因敲除鼠HF时较野生型大鼠HF时I型胶原表达下降，但α-SMA无明显变化，表明活化的HSC要产生胶原合成的最适表达必须有Smad 3参与，而HSC活化与Smad 3无关，但增殖与Smad 3有关。

TGF-β1的信号通路及自身信号通路之间的对话与其他细胞因子之间的对话仍存在未知问题，随着各种细胞因子信号通路的深入研究，我们将会对其相互作用机制有进一步的了解，为选择合适的HF治疗靶点提供依据。

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