供精个体和异种动物精浆对小鼠精子介导转染外源基因效率影响的研究

孙新明



供精个体和异种动物精浆对小鼠精子介导转染外源基因效率影响的研究

孙新明

（井冈山大学医学院，江西，吉安 343000）

探讨供精个体和异种动物精浆对小鼠精子转染外源DNA效率的影响，以探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的影响因素。从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，用DIG免疫组化方法检测和比较精子转染效率，因素为供精个体和异种动物精浆。不同供精个体间转染效率存在一定差异，但有的个体间差异极显著（< 0.01），而有的个体间差异不显著；共孵育体系中异种动物精浆可显著降低转染效率（实验组与对照组分别为(8.6 ± 1.7)% vs (51.3 ± 5.3)%，< 0.01）。小鼠供精个体和异种动物精浆可影响小鼠精子转染外源DNA的效率。

精子介导基因转染；供精个体；异种动物精浆；小鼠

精子介导基因转移(Sperm-mediated gene transfer, SMGT)是以精子为载体，在受精时将外源目的基因导入卵母细胞以制备转基因动物的一种简单而高效的方法学之一。由于其免去了显微注射法造成的原核损伤，便于转基因动物的研究和在生产中推广应用，因而是生产转基因动物的理想途径。但目前该方法存在很大的随机性和不确定性，特别是在小鼠，精子介导转染外源基因的效率极不稳定[1]，极大的影响了利用精子介导法制备转基因小鼠的应用与推广。

鉴于此，本实验就外源DNA与精子共孵育转基因方法中供精个体与异种动物精浆对精子转染外源基因效率的影响进行研究，以探讨影响小鼠精子介导转染外源基因效率的因素，为利用精子介导法制备转基因小鼠的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

昆明雄性8 周龄小鼠5只，山羊精浆取自农户饲养的性成熟、健康雄性本地羊。PEGFP-N1质粒由第三军医大学实验动物中心馈赠，大肠杆菌由井冈山大学医学生物实验室保存。

1.1.2 主要药品与试剂

主要试剂有肝素、卡那霉素、BSA、DMEM培养液均购于美国Sigma公司；DIG抗体-碱性磷酸酶复合物、DIG-dUPT末端标记试剂盒购于Roche公司；I和III购于Takara公司；DMEM购于GIBCO公司；质粒大量抽提试剂盒购于Omega公司；Ⅰ购自MBI公司。缓冲液Ⅰ(Tris-HCl 100 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，pH 7.5)、缓冲液Ⅱ(Tris-HCl 100 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，MgCl250 mmol/L,pH 9.5)、缓冲液Ⅲ(Tris-HCl 10mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 8.0)和亮绿复染液（1%）均为自制。

1.2 方法

1.2.1 外源基因的准备

质粒的转化、筛选（50 µg/mL卡那霉素）、扩大培养及质粒抽提参考《分子克隆实验指南》[2]和试剂盒操作说明书进行，用I和III行双酶切鉴定，用I行单酶切获得线性化质粒片段，溶于TE缓冲液中，比色法测定DNA浓度并调节浓度为20 µg/m L后低温保存备用。

1.2.2 制备精子悬浮液

将性成熟雄鼠单独饲养 3 d 后，脱颈椎处死，腹部消毒，沿腹正中切开，取出附睾及输精管，用小镊子挤压附睾尾部及输精管使精子挤入预先保存于CO2培养箱（37 ℃，5%CO2，湿度99%）内的0.5 mL FM获能液[3]培养瓶中，然后再放回CO2培养箱中，20~25 min，使精子自由浮动。

1.2.2.1 精子获能

取10 µL上述初步孵育、分散较好的活跃精子悬浮液加入到50 µL预先保存于CO2培养箱的FM获能液中置于CO2培养箱中继续培养2 h使精子获能。其间吸取少量悬液用血球计数板进行计数确定精子的浓度。

1.2.2.2 精子转染

获能后的精子按 1μgDNA/1~3×106个精子比例加入线性化 pEGFP-N1 质粒 DNA，轻轻混合, 置CO2培养箱孵育40~60 min，使精子吸附、内化转染外源基因。

1.2.2.3 转染精子的后处理

所有处理样品加入2 IU/mLⅠ后于37℃消化1 h，用4%的多聚甲醛PBS缓冲液固定20 min，用5倍FM液1500 rpm/min × 5 min洗涤3次，再混匀悬浮、涂片，备用。

1.2.2.4 转染样品的阳性检测

将上述涂片进行以下处理：PBS浸洗2×5 min；缓冲液Ⅰ冲洗10 min；封闭液封闭30 min；滴加DIG单抗-碱性磷酸酶复合物(1:500~1:1000)，25℃下作用30 min；缓冲液Ⅰ洗片15 min×2；缓冲液Ⅱ平衡5~10 min，滴加显色液(40 µL/mL NBT/BCIP)显色1 h以上；加缓冲液Ⅲ终止反应5 min；PBS洗片5 min×2；亮绿液复染1 h，空气干燥，蒸馏水冲洗，镜检（至少数300个精子），计算阳性精子转染效率。每个精子样品2~3张，阳性率差异不超过10%。

1.2.3 实验分组与设计

1.2.3.1 供精个体对转染效率的影响

将5只性成熟并有配种能力的雄鼠，每只小鼠的获能精液各制备3份进行转染和转染后检测，比较各供精个体的精子阳性转染率。

1.2.3.2 异种动物精浆对精子转染效率的影响

精子获能后悬浮液分成2份，1份加入5倍体积山羊精浆于培养箱条件下与外源DNA共同孵育，另一份不加异种动物精浆处理作为对照组，比较两者间阳性转染率，以探讨异种动物精浆对转染效率的影响。

1.2.4 统计分析

所有实验数据用SPSS for Windows(11.0)软件中的One-way Anova进行统计分析，LSD方法多重比较各种因素对小鼠精子转染效率的影响。

2 结果

2.1 供精个体对转染效率的影响

各供精个体的精子转染效率统计结果见表1。结果显示，不同供精个体间转染效率存在差异，其中1号公鼠与其他各雄鼠间及2号公鼠与3号公鼠间差异极显著（< 0.01），2号公鼠与4号公鼠间差异显著（< 0.05），其他公鼠间差异不显著（> 0.05）。

表1 供精个体对转染效率的影响

注：同列肩注字母A与其他各字母和B与C间差异极显著(< 0.01)， B与D间差异显著(< 0.05)，C、D和E两两之间无显著差(> 0.05)。

2.2 精子与外源DNA共孵育过程中异种动物精浆对转染效率的影响

异种动物精浆对小鼠精子转染效率的影响统计结果见表2。结果显示，异种动物精浆对小鼠精子转染效率具有显著影响（< 0.01）。

表2 共孵育过程中异种动物精浆对转染效率的影响

注：同列不同肩注字母间差异极显著（< 0.01）。

3 讨论

3.1 小鼠能自发转染外源DNA，但存在个体差异

动物精子能自发结合外源DNA已被很多研究者所证实[1,3-4]，且各种动物精子结合外源DNA的能力不一样，其中猪和羊等动物的精子结合外源DNA的阳性率通常为25~40%，小鼠为40~60%，兔为15%~87%[4]。但精子介导转基因研究发现，转染后外源DNA分子可能存在于精子细胞膜表面，也可能被内化进入精子内，而一般认为外源DNA只有被内化并与精子细胞核发生紧密联系才有可能在受精时与合子基因组进行整合，最终产生转基因动物，因此外源DNA能否进入细胞内是关键。

精子结合外源DNA受多重因素影响，本实验对简单共孵育法转染的小鼠精子进行免疫组化检测时发现，不同动物个体的精子转染外源基因效率存在巨大差异，与目前的同类报道一致[5]。

3.2 精浆中抑制因子对外源基因的结合抑制作用可跨越物种界限

本实验结果表明，将去除精浆后的小鼠精子加入山羊精浆稀释并与外源DNA共处理的转染阳性率显著低于对照组，说明异种动物精浆与同种动物的一样，可强烈抑制精子转染外源DNA。这一结果支持了Spadafora等得出的关于各种动物精浆中均存在结构和功能相同或相似的抑制因子的结论，且该因子的结构和功能在动物间可能存在高度保守性，可抑制外源DNA结合到精子表面DNA结合蛋白(DPB)上[6]。关于精浆的抑制作用，有研究者从哺乳动物精浆分离到能拮抗精子结合DNA的抑制因子(inhibition factor, IF-1)，该因子与外源DNA结合的部位相同，可选择性地结合在精子核后帽区[7]。笔者对山羊精子转染外源基因的研究中也发现相似的结果[8]。精浆中的IF-1因子抑制精子结合转染外源DNA，对维持物种的遗传稳定性具有重大的意义，可以免受精子基因组被外源DNA的随意侵入而破坏其遗传稳定性，是动物物种进化的必然结果[9]。

[1] Spadafora C. Sperm-mediated gene transfer: mechanisms and implications[J]. Soc Reprod Fertil Suppl,2007,65: 459-467.

[2] 萨姆布鲁克, EF 弗里奇, T 曼尼啊蒂斯(美), 分子克隆实验指南[M]. 金冬雁,黎孟枫等译2版. 北京:科学出版社, 1996.

[3] Lavitrano M, Camaioni A, Fazio V M, et al. Sperm cells as vector for introduction foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice[J]. Cell, 1989, 57: 717-723.

[4] Gandolfi F. Sperm-mediated transgenesis [J]. Theriogenology, 2000,53(1): 127-37.

[5] 武坚, 刘明军, 李文蓉, 等. 精子载体介导法生产转基因绵羊的研究[J]. 草食家畜, 2001（增刊）: 186-190.

[6] Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation [J]. BioEssays, 1998, 20(11): 955-964. Review.

[7] Zani M, Lavitrano M, French D, et al. The mechanism of binding of exogenous DNA to sperm cells: factors controlling the DNA uptake [J]. Exp Cell Res, 1995, 217 (1): 57-64.

[8] 孙新明, 邱效武, 江嘉陵, 等. 山羊精子介导法转染外源基因影响因素及最适条件的研究[J]. 生物技术通报, 2009(增刊): 310-314, 330.

[9] 孙新明, 蒋芬, 刘页玲. 精子介导法生产转基因动物研究进展[J]. 井冈山学院学报, 2009, 30(2): 66-71.

The effect of sperm donor and heterogeneous seminal plasma on the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA by sperm-mediated gene transfer in mice

SUN Xin-ming

(School of Medicine，Jinggangshan University，Jian, Jiangxi 343009, China)

The effect of individual and heterogeneous seminal plasma on the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA were investigated to explore the effecting factors of sperms used as carriers of foreign gene for generating transgenic mice.The sperms were taken from the vas deferens and ductus epididymidis of mature mice, donors of sperm, seminal plasma of different types of animal as factors, and the transfection efficiency was detected and compared by DIG-labeled mono-cloned antibody.The positive transfection rates of sperms of different donors were different, but the difference was significant among some individuals (< 0.01), not among others. The transfection rates of sperm could be significantly decreased by foreign seminal plasma added in co-incubating buffer system(The transfection rates of experimental group and control group were(8.6 ± 1.7) % vs(51.3 ± 5.3) %, respectively,< 0.01).Sperm donor and heterogeneous seminal plasma can influence the efficiency of sperm transfecting exogenoius DNA in mice.

sperm-mediated gene transfer; sperm donor; heterogeneous seminal plasma; mice

1674-8085(2013)05-0090-03

S827

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.05.020

2013-06-16；

2013-07-22

孙新明(1968-)，男，贵州铜仁人，副教授，博士，主要从事胚胎工程和转基因动物研究(E-mail:sunxinming2007@163.com).