利用Photoshop软件处理芒属植物染色体图像的方法探讨

卢玉飞,蒋建雄,易自力

(湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128)

禾本科(Gramineae)芒属(Miscanthus)是一类C4高大禾草植物。因其生物产量高、碳中和、遗传适应性强以及适应边际土地(Marginal Land)种植，适宜作为新一代非粮能源植物开发利用[1-5]，因而成为当前国内外研究热点之一。芒属植物中的核型分析是一项常规性的重要实验工作，在芒属植物的亲缘关系、系统演化、品种鉴定和多倍体筛选等研究中具有重要意义。本研究在已有核型分析经验的基础上，参考一些教程[6-8]对图像处理软件Adobe Photoshop(CS2版)用法的介绍，系统地摸索在中国芒属植物的芒(Miscanthussinensis)、五节芒(M.floridulus)和荻(M.sacchariflorus)等类群的核型分析试验中应用该软件处理染色体图像的方法，以期为芒、五节芒、荻和南荻(M.lutarioriparius)等中国芒属种质资源大规模染色体倍性检测研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1试验材料 本研究在摸索过程中采用的染色体图像来自芒、五节芒和荻等类群的材料，野外采集其地下根状茎种植保存于湖南农业大学芒属种质资源圃内；本研究中的图例所采用的染色体图像来自一份芒，其原产地为广东珠海，编号为C0536。

1.2方法 在资源圃内取其幼嫩根尖，按常规的酶解离后压片的方法制备染色体玻片标本后进行镜检，选取染色体完整、清晰且分散良好的中期分裂相用Motic Images Advanced 3.2图像采集系统拍照，存为.bmp格式，之后采用Adobe Photoshop(CS2版)图像处理软件对获得的染色体图像进行处理。

2 结果

2.1染色体图像处理

2.1.1曝光度调整 如果曝光不足，图像灰蒙蒙，偏暗。调整方法如下：1)执行“图像/调整/色阶”和“图像/调整/亮度/对比度”或执行“图像/调整/曲线”，根据实时处理效果设置相关参数。2)或者执行“图像/调整/曝光度”，增加“曝光度”、减少“位移”和“灰度系数”。3)或者执行“图像/调整”的“阴影/高光”项，调节“阴影”、“高光”、“调整”的数值，使之达到满意效果。

如果曝光过度，图像偏亮，应着重调整高光。处理方法如下：1)参照“曝光不足”的纠正做法，反向调整。2)或者复制背景图层，执行“图像/调整/变化”，选择“暗调”选项，在较暗区域里单击(必要时可多单击几次)，接着选择“高光”后在较暗区域里单击，确认，该过程中视效果可适当降低“精细度”。3)或者在方法2)的基础上，为背景副本添加蒙版，选择“画笔”工具，调节不饱和度和流量，在染色体上擦除以增加染色体亮度。

2.1.2背景初步净化处理 刚获得的镜检原图往往都有背景污点，为了不影响观察和后续操作，有必要作初步的背景净化处理，擦除这些背景污点。做法：1)将“缩放”工具与“修补”工具配合使用。放大瑕疵处后，选择“修补”工具，创建污点选区，单击左键拖动选区向干净无瑕疵处移动污点，释放左键后取消选区即可。不过“修补”工具更适合去除较大面积的污点。小细节的瑕疵可在放大后，运用“修补画笔”工具，按住[Alt]键的同时到干净处单击取样，松左键移到瑕疵处单击，可覆盖瑕疵。2)或者选择“画笔”工具，按住[Alt]键，到干净处取样，后单击左键涂抹污点即可。如使用蒙版，不必取样，可直接用画笔擦除污点。3)或者使用“仿制图章”工具，在干净处按住[Alt]键的同时单击左键取样，后涂抹污点即可。4)或者使用“多边形套索”工具，在干净的背景创建选区，羽化，按住[Ctrl]键单击左键拖动选区覆盖污点。

2.1.3染色体区域转移 做法：1)将包含全部染色体的整个区域复制到另一新的文件中。背景为白色，分辨率至少300象素/英寸(下同)。粘贴后根据具体要求适当放大染色体图像。执行“编辑/自由变化”，在单击左键缩放变形框的同时，加按[Shift]键，让长宽等比例缩放，确认。2)或者新建图像副本图层，用“裁剪”工具在该图层里拖拽出需要保留的染色体区域，按[Enter]键即可裁去其它部分。但该方法有局限性，若无复制图层的习惯，使用裁剪工具往往容易裁剪掉后续操作中还可能用到的背景，最大的问题还是裁剪之后得到的染色体区域的图像无法缩放。

2.1.4图像的色彩与色调调整 前面的处理无法突出染色体，且染色体在放大后反而会略显模糊。为便于在后续环节中能完整提取染色体，有必要对染色体进行色彩与色调调整。色彩主要包括亮度、色相、饱和度和对比度；色调调整主要是对明暗度调整。调整时，要对比原图和未做调整前的图，确保调整准确。而且，不应先选择染色体再调整，因为一旦在原始图片里染色体不够清晰，那选择起来就难免有偏差。

方法：1)执行“图像/调整/曲线”功能，拉动节点改变线条的形状即可同时调整整个画面的亮度、对比度及色调。必要时(如图像偏绿)选择相应的颜色通道(如绿色)，调整曲线状态，直到预览的图像色调满意为止。然后还可通过“亮度/对比度”、“色相/饱和度”、“色彩平衡”及“可选颜色”等命令进一步调整。2)或者执行“图像/调整/色阶”，通过调整明暗度来改变图像的明暗和反差效果。3)或者执行“图像/调整”的“色相/饱和度”功能，选择“编辑”列表中除“全图”之外的任一种颜色，使用“添加到取样”吸管到染色体身上单击取色，提高饱和度(色相与亮度增加与否视预览效果而定)，同时配合移动对话框下方颜色条的滑块，把色彩与色调调至最佳。4)或者执行“图像/调整/替换颜色 ”，用“添加到取样”吸管工具到染色体上单击取色，在“替换”栏里移动“色散”、“饱和度”及“明度”的滑块，由预览效果来决定被替换的颜色。

比如，在上述几个类群的芒属植物染色体玻片标本制备实践中，因为染料的原因，拍出的染色体图像其背景常偏青(绿)，可尝试以下做法来减轻这种偏色现象：1)执行“图像/调整/色阶”，提高输入色阶的数值把图像变暗，接着提高中间色调数值使图像变亮，降低图像亮部色调使图像白色减少，再新建图层副本，将该副本图层模式改为“强光”、不透明度设定为“50%”，执行“色彩平衡”，减少青色和绿色的比例。2)或者执行“曲线”命令，选择“绿色”通道，根据预览结果精细调整绿色输入和输出值；之后选择“RGB”通道，进一步从总体上调整，最后执行“色相/饱和度”，减少“绿色”饱和度并稍稍减少其色散。

2.1.5背景去除 为了对染色体做进一步的精确分析，有必要将染色体整体提取出来(相当于去除背景)，以免后续分析时受背景干扰。总体思路是首先选择全部染色体而非单个选择，以确保所有染色体之间的相对位置保持不变。而且，这个过程中当放大染色体时就要确定染色体的合适大小并确保它们均按同一比例缩放，为后续进行同源染色体配对准备。

方法1)：选择“魔棒”工具，设定“容差”值(需反复比较哪个容差值更趋向于能正好选择完染色体，笔者常采用约50的值)，让“连续”选项处于非选择状态，在染色体上创建染色体选区，放大图像，选择“多边形套索”工具，按[Shift]键的同时框选遗漏的区域(浅染区常常被漏选)或按[Alt]键减选多余背景，将完整的染色体选区粘贴到另一新建文件，放大图像，对照原图，并根据此前已明确的染色体数目和交叉重叠区域，主要应用“多边形套索”工具和“橡皮擦”工具进一步修正，包括删减多余背景、复原此前漏选的着色浅的染色体部位，确保还原染色体在原始图片里呈现的真实特征，得到边缘清晰且背景干净的染色体图谱。

方法2)：执行“选择/色彩范围”， 在“色彩范围”对话框选择“图像”来显示染色体图像，同时设定一个合适的“容差”值(比如50左右)，综合运用所提供的吸管工具在染色体上单击选择，创建了尽可能完整的染色体选区，后面步骤同方法1)。如果背景均匀、色彩单一时，执行该命令单击背景取样，然后按[Delete]键删除背景留下染色体，重复多次可把背景尽可能删除，最好再执行上述方法1)就可以更完整清晰地选取染色体。

方法3)：执行“通道抠图”。打开染色体图像，转到通道面板，复制与背景色相近的那个通道得到副本，调整“色阶”参数(以便最后能完整选择染色体)，按 [Ctrl]键，同时单击刚才复制的通道副本，创建染色体选区，反选，回到图层面板，单击“多边形套索”工具，按[Shift]键时继续选择，以增加此前被遗漏的染色体选区(反之，按[Alt]键)。

说明：1)不建议使用“背景橡皮擦工具”或“魔术橡皮擦”工具来擦除背景。使用前者擦除后会遗留一些细微污点，而后者会自动擦除颜色相近区域，极易擦掉染色体的部分边缘。2)可尝试通过加大景深的方法来突出染色体，有助于对其选择。即：①用“修补”工具擦除背景污点，新建该图像的副本图层，对这个副本图层执行“滤镜/模糊”(由预览效果决定选何种模糊方式，笔者常用高斯模糊)，给这个副本图层增加一个图层蒙版，确定前景色为黑色，背景色为白色，用画笔仔细涂抹即可擦除染色体的蒙版，染色体将变得清晰并加大与背景的反差。或②选择染色体后，反选，先后执行“选择/修改/扩展(笔者常用2象素)”和“选择/修改/平滑(取样半径3象素)”，再先后执行高斯模糊、背景模糊。3)不主张使用“滤镜”的“抽出”命令来抽出染色体而达到去除背景的目的。尽管它比橡皮擦工具更加智能化，但是执行该命令需要逐个勾画出染色体，一是工作量的问题，最要紧的是如果不够熟练，勾画染色体时将极易产生偏差。4)同样不主张使用“钢笔”工具来创建染色体选区。因为绘制每个染色体选区，不仅工作量让人难以坚持，而且绘制染色体边缘时一是易出错，二是整个路径不平滑不自然。同样，不主张使用“套索”工具。

2.1.6交叉染色体分离 本文所言的染色体交叉包含染色体交错或部分重叠两种情况，尚未在实践中发现两条染色体完全重叠的情况。为了实现后续的染色体长度测量及同源染色体配对，需要将发生交叉的染色体分离。

操作方法如下(这里不考虑进行带型分析的情况)：放大发生交叉的两条染色体，用“多边形套索”工具绘制出交叉染色体中的任一条，转化成选区，使用“移动”工具将选区复制到原交叉区域附近空白处，使用“多边形套索”工具，在原处选择这条染色体除交叉区域之外的剩余部分并删除，这时在原处就只剩下另一条染色体了，这相当于交叉的两条染色体实现了分离。如果是两条以上的染色体发生交叉，实现分离的操作方法类似。必要时对分离后染色体的不平滑边缘再做修整(图1)。

说明：不应先移动任一条染色体的非交叉区域，再复制交叉区域来填补。因为这种“先移后补”的做法会很容易使得被填补的公共区域无法与原染色体自然融为一体。而前面“先复制后删除”的做法却能保持整条染色体的完整性。

2.2同源染色体配对 染色体图像经过上述处理后，此时可直接选一个镜检原图最清晰、染色体分散程度高且图像处理效果也最佳的分裂相，根据事先已明确的这个分裂相里同源染色体的配对情况，从中选择染色体来完成配对。做法：复制一份已分开交叉染色体且已编号的图谱为操作对象，对照原图运用“魔棒”工具逐条选择染色体并剪切粘贴到新建文件中，保持大小不变，短臂统一朝上。最后，保存文件，以便单独使用配对图时方便取用。而且，要在这个配对图旁边加上该分裂相的镜检原图以及刚去除背景后的图像和分离了交叉染色体后的图像，以便比较(图1)。

2.3核型模式图绘制 基于染色体核型参数中的相关测量值，在Excel中按照已有方法[9]生成柱状图，随后将此图粘贴到新建的Photoshop文件中编辑，使用该软件里的“钢笔”工具及其他相关工具在该文件窗口的纵向参考线以及横向网格线的定位下在柱状图上绘制表示着丝点位置的对称缺刻。

图1 编号为C0536的芒(M.sinensis)的核型图谱Fig.1 Karyotype of an accession (No.C0536)of M.sinensis

3 讨论与结论

核型分析是早已发展起来的常规实验技术，但传统的方法步骤比较繁多[10]，在实际操作中不仅耗时费力，也往往容易出现人为误差[10-11]。现在随着通过采用显微数码摄影技术来获取染色体图像的相关仪器软件的普及应用，客观上也要求运用相关软件对染色体图像进行后期处理。

Adobe Photoshop是图像处理功能强大的常用软件。虽然有不少资料和网站介绍这个软件的用法，其思路和方法可以供染色体图像处理时借鉴参考，但染色体图像处理有其特殊性，显然不同于一般照片处理，在具备专业背景的前提下要求更为细致，尤其对染色体数目较多(2n=38)且微小的上述类群的芒属植物而言，对其染色体图像的处理更需如此。近年已有一些报道介绍在进行核型分析时应用Photoshop软件处理染色体图像[10,12-15]，效率较高，这表明了在核型分析等相关工作中应用该软件处理染色体图像的可操作性。不过，这些报道所述方法往往侧重于核型分析过程中有关染色体图像处理的某一或某些环节，而在系统性与适用性方面似有不足。

本研究试图系统地探讨利用Photoshop软件处理上述几个类群的芒属植物染色体图像的处理方法。因此，本文在注重对整个分析思路进行阐述的同时，注重在具体操作方法上予以描述，力图做到周到、详尽。对不少环节还提供了多种方法以便读者参考、比较，并说明了一些注意点，旨在帮助读者形成更完整、清晰的染色体图像处理思路。在芒、五节芒和荻等类群的核型分析中的应用实践也表明本文所述方法的可操作性和适用性较强，使用效果较佳。所以，笔者希望本研究对其他类群植物的染色体图像处理也有参考价值。碍于篇幅限制，一些操作细节未能阐述。此外，一些做法，比如利用此软件的测量功能对染色体进行测量的做法本文也略去，因为已有文献[12-15]阐述。总之，笔者希望本文能为相关研究提供多一种解决问题的参考思路。

[1] 刘亮,朱明,朱太平.芒荻类植物资源的开发和利用[J].自然资源学报,2001,16(6):562-563.

[2] Heaton E A,Clifton-Brown J,Voigt T B,etal.Miscanthus for renewable energy generation:european union experience and projections for Illinois[J].Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change,2004,9(4):433-451.

[3] Clifton-Brown J,Chiang Y C,Hodkinson T R.Miscanthus:Genetic resources and breeding potential to enhance bioenergy production[A].In:Vermerris W.Genetic Improvement of Bioenergy Crops[M].New York:Springer Science+Business Media,LLC,2008:273-294.

[4] Jakob K,Zhou F S,Paterson A H.Genetic improvement of C4grasses as cellulosic biofuel feedstocks[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant,2009,45(3):291-305.

[5] Sang T,Zhu W X.China’s bioenergy potential[J].GCB Bioenergy,2011,3(2):79-90.

[6] 籍宁,杨彦岭.Photoshop CS2中文版完全自学手册[M].北京:电子工业出版社,2007:1-606.

[7] 清风书坊.中文版Photoshop CS2家庭数码照片暗房72技[M].北京:兵器工业出版社,2007:1-281.

[8] 麦伟彬,平燕波.光影传奇——中文Photoshop数码照片处理典型实例[M].北京:机械工业出版社,北京科海电子出版社，2007：1-342.

[9] 乔永刚,宋芸.利用EXCLE制作核型模式图[J].农业网络信息,2006(10):97-98.

[10] 蒋姗姗,梁英民,王作军.利用个人电脑系统及photoshop软件进行核型分析[J].第四军医大学学报,2000,21(7):860.

[11] 刘丽琴,胡玉林,石胜友,等.基于MATLAB图像处理的染色体核型分析[J].广东农业科学，2013(1):185-187.

[12] 周友泉,王厚照.PHOTOSHOP在染色体参数测量中的应用[J].江西医学检验,2003,21(1):43，24.

[13] 杨大翔.用Adobe Photoshop进行核型分析[J].农业网络信息,2005(3):45-46，44.

[14] 周劲松,苏小波,汤泳萍,等.利用Photoshop进行芦笋核型分析的研究[J].江西农业学报,2009,21(2):73-75.

[15] 周洲,顾曙余.核型分析实验中的图像处理[J].生物学杂志,2010,27(6):95-96，99.