鸡骨草醇提物体外抗氧化自由基作用研究

林明霞，李涂蓝，潘冬贵，黄锁义*

(右江民族医学院，a.药学院；b.临床学院，广西 百色 533000)

鸡骨草醇提物体外抗氧化自由基作用研究

林明霞a，李涂蓝a，潘冬贵b，黄锁义a*

(右江民族医学院，a.药学院；b.临床学院，广西 百色 533000)

目的 测定鸡骨草醇提物体外抗氧化自由基作用，为充分利用鸡骨草资源提供理论依据。方法 鸡骨草饮片以65%乙醇作为溶剂，pH=3条件下浸泡24 h，通过分光光度法测定鸡骨草醇提物清除超氧自由基(·O2-)、羟自由基(·OH)能力和清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力，普鲁士法测定其还原Fe3+能力，并以丁基羟基茴香醚(butylated hydroxylanisole，BHA)作对照测定鸡骨草醇提物对金属离子Fe2+螯合能力。结果 鸡骨草醇提物具有较强的清除·O2-、·OH、DPPH自由基能力，并能还原Fe3+和螯合Fe2+。结论 鸡骨草醇提物具有较强抗氧化作用，其抗氧化性随着浓度的增大而增强。

鸡骨草；醇提物；抗氧化作用；清除；自由基；螯合

鸡骨草是豆科相思子属的植物，常见于中国华南地区，自然生长于深山隐谷处，气味辛、甘，性质温和，香气四溢。药用干燥全株，有清热利湿、解毒止痛的功效，对急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛等疗效显著。鸡骨草全草主要含相思子碱、甾醇化合物、皂苷、黄酮类、大黄酚、大黄素甲醚、氨基酸、胆碱、蒽醌类等化合物[1-3]。为进一步拓展其应用，本实验以鸡骨草作为原料，研究了其醇提液体外抗氧化自由基作用，为开发和利用鸡骨草的药用价值提供理论依据。

1 材料、试剂与设备

1.1 材料

鸡骨草干品(产于广西玉林，经右江民族医学院民族中药学教研室刘春荣副教授鉴定为Abrus cantoniensis Hance的干燥全草)，粉碎，于65%乙醇pH=3室温中浸泡24 h[4]，过滤后低温浓缩，自然晾干成浸膏备用。

1.2 试剂

盐酸(西陇化工股份有限公司，批号：110725)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)上海山浦化工有限公司，批号：20051010)；邻苯三酚(贵州遵义佳宏化工有限责任公司，批号：080112)；水杨酸(成都市科龙化工试剂厂，批号：20070722)；硫酸亚铁(国药集团化学试剂有限公司，批号：20040712)；过氧化氢(天津市富宇精细化工有限公司，批号：110120)；无水乙醇(天津市北联精细化学品开发有限公司，批号：20111008)；DPPH (Aladdin industrial Corporation，批号：H1201006)；磷酸盐缓冲液(上海雷磁创益仪器表有限公司，批号：20011211)；铁氰化钾(天津市福晨化学试剂厂，批号：20050425)；三氯乙酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20050409)；三氯化铁(上海实意化学试剂有限公司，批号：20050328)；BHA (Aladdin industrial Corporation，批号：45023)；菲洛嗪(Aladdin industrial Corporation，批号：H1201006)。

1.3 仪器

GN2085电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；SHZ-DIII循环真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；RE-3000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；HHS-21-4电热式恒温水浴(江苏金坛宏凯仪器厂)；722N可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 鸡骨草醇提液的制备

分别称取鸡骨草浸膏若干，用65%乙醇溶解后定容于100 mL量瓶，配成不同浓度的溶液备用。

2.2 鸡骨草醇提液体外抗活性氧自由基作用研究

2.2.1 鸡骨草醇提液清除超氧自由基(·O2-)作用取pH 8.2的Tris-HCl缓冲液4.50 mL于干燥具塞比色管中，加入3.20 mL蒸馏水，混匀后置25 ℃恒温水浴预热20 min，取出后分别加入在25 ℃恒温水浴预热20 min的浓度为0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg·mL-1的样品1.00 mL和3 mmol·L-1的邻苯三酚0.30 mL，混匀后静置反应4 min，立即加入10 mmol·L-1HCl 2滴终止反应，以Tris-HCl缓冲液做参比，在321 nm处测定吸光度A。按下式计算清除率：

其中，A0：加邻苯三酚但不加样品时的吸光度；A1：加样品和邻苯三酚时的吸光度；A2：加样品但不加邻苯三酚时的吸光度。

随着鸡骨草醇提物浓度的增加，对·O2-清除能力增强，当浓度为0.10 mg·mL-1时，清除率即超过IC50，说明鸡骨草对超氧自由基有很强的清除能力。结果见图1。

图1 不同浓度的鸡骨草醇提物对超氧自由基的清除能力Fig 1 The oxygen radical scavenging capacity of different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba

2.2.2 清除羟基自由基能力 采用Fenton反应体系产生羟基自由基。利用H2O2与Fe2+反应产生·OH，向体系中加入水杨酸捕捉并产生有色物质，在10 mL具塞比色管中依次加9 mmol·L-1FeSO41 mL，9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液2.00 mL，充分混匀后分别加入浓度为0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 mg·mL-1的鸡骨草醇提物溶液2.00 mL，最后加入8.8 mmol·L-1H2O22 mL启动反应，室温反应1 h，并与空白液比较，于510 nm处测定其吸光度，平行3次。按下式计算清除率：

其中，A1：空白对照液的吸光度；A2：加样品时的吸光度。

鸡骨草提取液对羟自由基有较强的清除作用，0.05 mg·mL-1时清除率即有36.2%，当浓度达到0.6 mg·mL-1时，清除率即超过IC50，结果见图2。

图2 不同浓度的鸡骨草醇提物对羟自由基的清除率变化关系Fig 2 The relationship between different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba and the clear rate of ·OH

2.2.3 清除DPPH自由基能力 DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，具有单一电子，能接受一个电子或氢离子，与氧化剂发生反应，提H被还原，颜色发生变化，由深紫色变为淡黄色，在波长为517 nm下具有最大吸收，可用紫外分光光度法测定。以高浓度逐渐稀释的方式检测不同浓度样品溶液对自由基的清除率，以自由基清除率为50%是样品的浓度(IC50)来衡量样品对自由基的清除能力。IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强。

取新配制的(6×10-4mol·L-1)DPPH溶液0.5 mL，分别加入浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·mL-1的样品溶液，混匀后用无水乙醇定容至5 mL，室温下暗光反应30 min，在517 nm处测定其吸光度A，平行3次。按下式计算清除率。

其中，A1：空白吸光度(t=0 min)；A2：反应30 min后吸光度。

在一定的浓度范围内，鸡骨草对DPPH自由基的清除效率和浓度呈一定的量效关系，随着醇提物浓度的增加，鸡骨草对DPPH自由基的清除率也逐步增加。当浓度达到0.08 mg·mL-1时清除率即超过IC50。这些结果说明鸡骨草醇提物在一定浓度范围内对DPPH自由基具有一定的清除活性。结果见图3。

图3 不同浓度的鸡骨草醇提液对DPPH自由基的清除率变化关系Fig 3 The relationship between different concentrations of the ethanol extracts of Abri Herba and the clear rate of DPPH

2.2.4 还原Fe3+能力采用普鲁士兰法测定样品还原Fe3+能力。在系列10 mL具塞比色管中依次加入2.5 mL浓度为0.01，0.02，0.05，0.10 mg·mL-1的样品溶液，2.5 mL 0.2 mol·L-1pH 6.6磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾，混匀后置于50 ℃水浴中反应20 min，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，如溶液浑浊离心(3 000 r·min-1)10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL和0.1%的三氯化铁溶液0.5 mL，混匀，以试剂空白作参比，在700 nm处测定吸光度值，吸光度值增加表明还原力增强。

随着醇提物浓度的增大，还原Fe3+增强，吸光度增加，说明鸡骨草有一定的抗氧化作用，结果见图4。

图4 不同浓度的鸡骨草醇提液还原Fe3+变化关系Fig 4 The relationship between different concentrations the ethanol extracts of Abri Herba and reduction the ferric

2.2.5 金属离子(Fe2+)螯合能力 取相同浓度不同体积的样品及对照品BHA溶液于系列10 mL比色管中，加入0.2 mol·L-1FeSO40.1 mL溶液中，混匀，再加入5 mol·L-1菲洛嗪0.2 mL，用65%乙醇定容到5 mL，剧烈振荡混合物后，室温下放置10 min。试剂空白作参比，于562 nm处测定吸光度，平行3次。吸光度值越低表示金属螯合能力越强。

其中，A0：不加样品时的吸光度值；A1：加入样品时的吸光度值。

鸡骨草醇提液和BHA都有螯合Fe2+的能力，且随着浓度的增大螯合能力增强，但BHA对Fe2+的螯合能力强于鸡骨草醇提液。结果见图5。

图5 鸡骨草醇提物、BHA对Fe2+的螯合能力Fig 5 The ability of ethanol extracts of Abri Herba and BHA chelating Fe2+

3 讨论

鸡骨草醇提物体外抗氧化性试验表明，鸡骨草具有较强的还原能力，对自由基有良好的清除作用。鸡骨草具有较强清除超氧自由基和羟自由基的能力；可作为电子供体，将Fe3+还原为Fe2+；当醇提物浓度达到0.08 mg·mL-1时对DPPH的清除率即超过IC50。鸡骨草醇提物具有螯合Fe2+能力，但其螯合能力比BHA弱。

有资料显示，自由基可介导机体组织脂质过氧化、蛋白质解聚、核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变，导致各种疾病发生和加速机体衰老。随着社会的发展和生活水平的进一步提高，人们对天然抗氧化物质的需求量也逐年增加，对天然药物的抗氧化活性的研究也逐渐增加[5-6]。从本实验可看出，鸡骨草醇提物具有明显的抗氧化作用，这预示着它在医学和人类保健事业上具有潜在的利用价值。本实验为鸡骨草的开发利用提供了合理的依据。

REFERENCES

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[2] HUANG R S, LUO Y M, HU Y, et al. Study on the content of total saponins and its accumulation trend in Chicken-bone Herba [J].Guangxi Agr Sci(广西农业科学), 2006, 37(4):391-393.

[3] SHI H M, WEN J, TU P F, et al. Chemical constituents of Abrus cantoniensis [J]. Chin Tradi Herb Drugs(中草药), 2006, 37(11): 1610-1613.

[4] CHEN X, XIAO C Y, MO L L, et al. Extraction and stability study on Euphorbia thymifolia red pigment [J]. Technol Dev Chem Ind(化工技术与开发), 2010, 39(3): 10-12.

[5] LIU C H, WANG A L, LI Y Q, et al. Determination of antioxidation of polysaccharides in Tussilago farfara [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2011, 28(10): 886-889.

[6] LIU Y J, CHEN D, QIU H X, et al. In vitro antioxidant effect of the total flavones of citrus Aurantium L. var Daidai Tanaka fruits [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2012, 29(2): 97-101.

Study on the in Vitro Antioxidant Activity of the Ethanol Extracts from Abri Herba

LIN Mingxiaa, LI Tulana, PAN Dongguib, HUANG Suoyia*
(Youjiang Medical University for Nationalities, a.School of Pharmacy; b.School of Clinical Medicine, Baise 533000, China)

OBJECTIVE To study in vitro antioxidant activity of the ethanol extracts from Abri Herba, and provide the theory to make use of Abri Herba. METHODS Abri Herba was soaked for 24 h with 65% ethanol as solvent and under the condition of pH=3, the abilities of the ethanol extracts of clearing ·O2-, ·OH, and DPPH were assayed by spectrophotometry. The ability of reducing Fe3+was detected with Prussia methodand, and chelating Fe2+was detected comparison to BHA. RESULTS The ethanol extracts of Abri Herba could effectively clear ·O2-, ·OH and DPPH, and reduce Fe3+, chelate Fe2+. CONCLUTION The ethanol extracts of Abri Herba antioxidation is strong, and its antioxidant activity was enhanced with the increase of concentration.

Abri Herba; the ethanol extracts; anti-oxidant activity; scavenging; hydroxyl radical; chelating

R285.5

A

1007-7693(2013)10-1047-04

2013-01-14

国家中医药管理局“十二五”中医药重点学科建设项目(国中医药人教发[2012]32号)；广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA 019240)；2013年度右江民族医学院大学生创新训练计划立项项目(XJCCX201369)

林明霞，女 Tel: 18778683216 E-mail: linmingxia1@163.com*

黄锁义，男，教授，硕导 Tel: (0776)2850590 E-mail: huangsuoyi@163.com