“黑美人”土豆黄酮提取及抗氧化活性

李彩霞，高海宁，焦 扬，吴冬青，张 勇,*，羊 艳

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.河西学院化学化工学院，甘肃 张掖 734000)

“黑美人”土豆黄酮提取及抗氧化活性

李彩霞1,2，高海宁1,2，焦 扬1,2，吴冬青2,3，张 勇1,2,*，羊 艳1

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000；3.河西学院化学化工学院，甘肃 张掖 734000)

对黑美人土豆黄酮提取工艺及抗氧化性进行了研究。结果表明，影响黑美人土豆黄酮提取率的主要因素为温度、料液比和乙醇体积分数；最优工艺条件为提取温度78℃、乙醇体积分数62%，料液比1:35(g/mL)。在此工艺条件下，最大响应值(1.04%)和实验测定值(1.03%)相符合，说明响应面法优化黑美人土豆黄酮是可行和有效的。黑美人土豆黄酮提取物与VC、芦丁相比较清除DPPH自由基能力大于芦丁小于VC；黄酮质量浓度在不高于20μg/mL时清除ABTS自由基的能力和抗氧化力大于VC，但始终大于同质量浓度的芦丁，结果显示黑美人土豆黄酮提取物具有显著的抗氧化活性，可以作为潜在的抗氧化剂或功能性食品资源。

“黑美人”土豆；黄酮；提取工艺；抗氧化

“黑美人”土豆是由甘肃兰州陇神航天育种研究所育成的新品种，其秧苗是黑紫色，表皮呈黑色，薯肉为黑色，它含有脂肪、蛋白质、及少量的钙、镁、钾等多种营养成分，素有“地下苹果”和“第二面包之称”[1]，黑美人土豆富含的花青素[2]，具有抗癌[3]、抗衰老、抗病毒[4]、抗氧化[5-6]、保肝[7]、美容和防治高血压等多种药理和保健作用，是一种药食兼用的特色健康食品。目前“黑美人”土豆研究仅见多酚氧化酶活性[8]、引种栽培[1]、有关花青素的提取[9]及色素稳定性[2]方面的报道，而对其黄酮提取工艺与其抗氧化性方面研究尚未见报道。

本实验在前期工作的基础上，利用乙醇回流法提取黄酮，采用中心组合设计，通过响应面分析法对影响黑美人土豆黄酮的主要工艺参数进行优化；并且对其清除DPPH、ABTS自由基以及总抗氧化力进行了测定，为建立黑美人土豆黄酮的优化条件以及为黑美人土豆活性成分的开发利用提供信息资料。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

黑美人土豆购于民乐县新天铺，清洗掉泥土，用不锈钢刀具切片，105℃灭酶，真空干燥、粉碎避光保存。

芦丁(rutin) 国药集团化学制剂有限责任公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等药品为国产分析纯；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒 南京建成生物工程研究所；二苯代苦味肼基(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical，DPPH)、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸(ABTS) 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；CR21GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司；SHZ-2000型双配套循环水式多用真空泵 河南省巩义市英峪予华仪器厂；S24分光光度计 上海棱光技术有限公司；RE-2000A旋转蒸发器 巩义市京华仪器有限责任公司；AE200电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 黄酮的提取

1.3.1.1 单因素试验

称取1.00g黑美人土豆粉末于100mL蒸馏瓶中，按不同料液比，加入一定量不同体积分数的乙醇，在一定温度和时间下回流提取，冷却后，5000r/min离心10min，上清液置于50mL容量瓶中，并用相应体积分数的乙醇定容，用于黄酮含量的测定。

1.3.1.2 黑美人土豆黄酮提取条件试验设计

在单因素试验基础上，以主要影响黑美人土豆中黄酮提取的乙醇体积分数、温度和料液比3个因素为自变量，进行3因素5水平的试验，因素水平编码见表1。中心组合试验设计(CCD)方案[10]及结果见表2。

表1 中心组合试验因素水平编码表Table1 Factors and their coded levels for central composite design

根据CCD设计组合方案进行试验，用统计软件SAS9.2对试验数据进行回归分析，推测出最佳提取工艺参数。

1.3.2 黄酮含量的测定

1.3.2.1 测定波长的确定

根据蒋益虹[11]的方法用芦丁标准液与黑美人土豆黄酮提取液进行显色反应，在400～600nm下扫描，确定黄酮测定波长。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品20.00mg，用少量75%乙醇溶解，转移至100mL容量瓶中，并定容至刻度。即芦丁标准品质量浓度为0.20mg/mL，冷藏备用。精确吸取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.30mL，摇匀，静置6min；然后加入10%硝酸铝溶液0.30mL，摇匀，静置6min；再加入4%氢氧化钠4.00mL，用30%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置15min，以试剂空白为参比，在502nm波长处测定吸光度。以吸光度(y)为纵坐标、芦丁质量浓度(x，mg/mL)为横坐标，制作标准曲线，得到回归方程为：y＝1.0258x＋0.004，R2＝0.9998。

1.4 抗氧化活性的测定

1.4.1 抗氧化物制备

在上述优化条件下提取的黑美人土豆黄酮提取液，在30～40℃减压浓缩，浓缩液黄酮质量浓度为2.39mg/mL，用75%乙醇溶液稀释成质量浓度为5.00、10.00、15.00、20.00、25.00μg/mL的黄酮溶液，以相应质量浓度的VC和芦丁为阳性对照。

1.4.2 黄酮提取物对DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基的清除能力采用吕英华等[12]的方法。1.4.3 黄酮提取物对ABTS＋自由基的清除能力

对ABTS＋自由基的清除能力测定参见文献[13]有改动，ABTS＋工作液：精密称取40.00mgABTS，加入1.0mg/mL的过硫酸钾溶液8.0mL，密封后避光静止反应16h，定量转移到250mL的容量瓶中，加32.00mL蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，放置10h后使用。根据测定吸光度的范围可用80%乙醇调整质量浓度。

提取物对自由基清除能力测定，准确吸取不同质量浓度的黑人土豆黄酮溶液0.50mL，分别加入0.80mL的ABTS＋工作液，然后加入2.70mL的80%的乙醇溶液，准确反应6min，在734nm测定吸光度Ai，样液对照组以等体积无水乙醇代替ABTS＋溶液(Aj)，对照组以等体积75%乙醇代替样品溶液(A0)，并以等体积75%乙醇和80%乙醇混合液作空白调零。清除率按下式计算，并以相应质量浓度的VC和芦丁为阳性对照。

1.4.4 黑美人土豆黄酮提取物的总抗氧化力测定

总抗氧化力测定严格按照试剂盒提供的方法，样品在520nm处测定吸光度，总抗氧化力的确定在37℃时，每毫升提取样品使反应体系的吸光度每增加0.01时为一个总抗氧化能力单位。

式中：AS为样品管吸光度；A0为对照管吸光度；3.7为反应体系总体积；0.2为测定样品体积；n为样品稀释倍数。1.4.5 数据处理

采用SAS9.2统计软件和Origin7.5进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 黄酮测定波长的确定

芦丁标样和黑美人土豆黄酮提取液通过NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色后，在400～600nm可见光区域扫描。结果显示，标样和样液显色后最大吸收峰在502nm处，故选择502nm作为黄酮测定波长。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对黄酮得率的影响

准确称取样品1.00g，用体积分数为75%乙醇的作为提取剂，料液比1:20(g/mL)，分别在温度20、40、60、80、100℃下提取1h，测定提取液中黄酮的得率，结果见图1。黄酮得率随温度升高而增加，当温度为80℃时，黄酮得率明显升高，之后上升比较缓慢，因为温度较高时导致黄酮物质结构发生变化，从而影响其活性[14]，因此选择提取温度不宜超过80℃。

图1 提取温度对黄酮得率的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.2 料液比对黄酮得率的影响

图2 料液比对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of flavonoids

准确称取样品1.00g，以体积分数75%的乙醇为提取剂，提取温度80℃，分别按料液比1:10、1:20、1:30、 1:40、1:50(g/mL)下提取1h，测定提取液中黄酮的得率，结果如图2。随着料液比的增大，黄酮得率相应增加，当料液比为1:40(g/mL)时，黄酮得率最高，之后黄酮得率下降，这是由于料液比达到一定比值时，黑美人土豆中黄酮已提取完全，故适宜的提取料液比为1:40(g/mL)。

2.2.3 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

准确称取样品1.00g，在提取温度80℃、料液比为1:40(g/mL)条件下，分别以体积分数为25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%和95%的乙醇提取1h，测定提取液中黄酮的得率，结果见图3。乙醇体积分数对黄酮提取影响比较大，随着体积分数的增加黄酮得率下降，乙醇体积分数越小提取率越大，说明黑美人土豆中的黄酮类化合物易溶于水，但是乙醇体积分数越小，后续处理比较费时。综合考虑以65%体积分数的乙醇为提取剂。

图3 乙醇体积分数对黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.4 提取时间对黄酮得率的影响

准确称取样品1.00g，在温度80℃、料液比1:40(g/mL)、体积分数65%的乙醇溶液中分别提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5h，测定提取液中黄酮得率，结果见图4。随着提取时间的延长黄酮的提取率增大，但变化幅度较小，在提取时间为1h时提取率为1.11%，在3.5h时提取率为1.28%，说明提取时间对黄酮提取率影响不显著，因此以下实验固定提取时间为1h，以影响黄酮提取率最大的3个因素进行CCD组合设计。

图4 提取时间对黄酮得率的影响Fig.4 Effect of time on the extraction efficiency of flavonoids

2.3 黄酮类化合物提取工艺回归模型的建立及响应面分析

2.3.1 回归方程的建立与检验

在单因素试验的基础上，对影响黄酮得率的主要因素温度、乙醇体积分数和料液比采用CCD试验设计，试验结果见表2 。

采用SAS 9.2软件进行统计分析，得到黑美人土豆中黄酮类化合物的提取率(Y)与温度(X1)、乙醇体积分数(X2)和料液比(X3)各因素变量间的函数关系：

为了说明回归方程的有效性及各因素对提取率的影响程度，对回归方程进行了方差分析，结果见表3。

表2 试验设计方案及结果Table2 Central composite design and results

从表3可以看出，温度、乙醇体积分数、料液比以及乙醇体积分数二次项与料液比二次项对黄酮类化合物提取率影响达到极显著水平(P＜0.01)；温度二次项、温度与乙醇体积分数的交互项、温度与料液比的交互项对黄酮类化合物提取率影响差异显著(P＜0.05)。同时对回归方程进行检验，回归模型检验极显著(P＜0.01)，此模型决定系数R2为96.91%，校正后R2为94.77%，表明方程拟合较好。变异系数为4.72%，说明实验操作可信，该方程与实际情况拟合很好，能够正确反映黑美人土豆黄酮的提取率与温度、乙醇体积分数和料液比之间的关系。

表3 回归方程的方差分析Table3 Variance analysis of regression equation

2.3.2 响应面分析与优化

图5 各因素交互作用对黄酮得率的影响Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of extraction parameters on the extraction efficiency of flavonoids

从图5A可以看出，随着温度的升高，黄酮的提取率逐渐增加；随着乙醇体积分数的增加，黄酮得率先缓慢上升，后迅速下降，其原因是乙醇体积分数不同，极性也不同，当乙醇体积分数在45%～65%之间，温度在80℃附近，响应值达到最大。

从图5B可以看出，温度对黄酮得率影响显著，随着温度的增加，黄酮得率增加；随着料液比的增加，黄酮得率先增加后减少，溶剂量加大，大量的杂质如多糖，蛋白等溶解出来，影响了黄酮的溶解性[15]，温度在80℃附近，料液比在1:40附近时响应值最大。

从图5C可以看出，随着料液比的增加，黄酮得率先迅速增加，后缓慢下降，随乙醇体积分数的增加，黄酮得率先缓慢上升，后迅速下降，当乙醇体积分数在在45%～65%之间，料液比在1:40附近时提取率最大，料液比对黄酮得率影响更大。

从图5分析可知，3个因素中温度对黄酮的提取率响影响最大，表现为曲线的倾斜度大，料液比和乙醇体积分数变化比较平缓，说明这两个因素对响应值影响较小。通过岭脊分析各因素最佳条件的编码值为：X1=0.87345、X2=-0.14323、X3=0.46538，即提取温度78℃、乙醇体积分数62%、料液比1:35(g/mL)，对优化结果进行验证，其实测值为1.03%，模型预测值为1.04%，实测值与预测值非常接近，证实了该模型的有效性。

2.4 黑美人土豆黄酮提取物抗氧化活性分析

2.4.1 对DPPH自由基清除活力

DPPH自由基是一种稳定的自由基，它被广泛做为抗氧化剂评价自由基清除活力的一种工具[16]。黑美人土豆黄酮对DPPH自由基的清除作用如图6所示。随着黑美人土豆黄酮提取物、VC和芦丁质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率增加，在质量浓度为25μg/mL时，对DPPH自由基的清除率分别为47.66%、91.50%和32.71%。以上数据说明，黑美人土豆黄酮提取物对DPPH自由基具有清除作用，其清除作用优于芦丁而小于VC。

图6 黄酮、VC和芦丁对DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of flavonoids from “Black Beauty” potatoes, VC and rutin

2.4.2 对ABTS自由基清除活力

图7 黄酮、VC和芦丁对ABTS自由基的清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of flavonoids from “Black Beauty” potatoes, VC and rutin

ABTS自由基清除法目前已广泛用于生物样品的总抗氧化力测定。在反应体系中，ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基，抗氧化剂反应后使其溶液褪色，特征吸光度降低，因此根据溶液的褪色程度，来判断该提取物或者被检测物的总抗氧化力[17]。黑美人土豆黄酮提取物对ABTS自由基清除活力清除作用如图7所示。对ABTS自由基清除率随着黄酮提取物、VC和芦丁质量浓度增加而增加，其相关系数分别为r＝0.9876，r＝0.9974和r＝0.9856，均呈线性相关。在质量浓度为25μg/mL时，黄酮提取物、VC和芦丁对ABTS自由基清除率分别为74.61%、77.39%、31.21%，黄酮提取物和VC对ABTS自由基IC50分别为14.60μg/mL和16.43μg/mL。以上数据表明黑美人土豆黄酮对ABTS自由基具有清除作用，在质量浓度不高于20μg/mL时其清除作用的大小为黄酮＞VC＞芦丁。2.4.3 黑美人土豆黄酮总抗氧化力测定

机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3＋还原成Fe2＋，Fe2＋可与菲啉类物质形成稳定的络合物，通过比色法测定其抗氧化力的高低，颜色越深，总抗氧化力越强[18]。黑美人土豆黄酮提取物的总抗氧化力如图8所示，黑美人土豆的抗氧化力与其黄酮质量浓度间的相关系数为r＝0.9982；而VC和芦丁的抗氧化力与其质量浓度间的相关系数分别为r＝0.9474和r＝0.9978，均呈线性相关。与对照VC和芦丁相比较，在质量浓度为20μg/mL时，其总抗氧化力分别为2.94、2.82U/mL和1.42U/mL，在低质量浓度时黑美人土豆黄酮的抗氧化能力明显高于VC和芦丁，但当质量浓度高于20μg/mL时，VC抗氧化能力高于黑美人土豆的黄酮提取物，这个变化趋势与对ABTS自由基清除趋势基本一致。

图8 黄酮、VC和芦丁的总抗氧化力Fig.8 Total antioxidant capacity of flavonoids from “Black Beauty”potatoes, VC and rutin

3 结 论

3.1 在单因素试验的基础上，通过CCD组合试验及响应面分析，得到提取黑美人土豆黄酮类化合物的最佳工艺条件：乙醇体积分数62%、温度78℃、料液比1:35(g/mL)。在此条件下，黄酮类化合物的提取率为1.03%，与模型预测值为1.04%非常接近。说明该工艺科学合理，安全有效，在黄酮类化合物提取过程中具有很好的应用前景。3.2 抗氧化试验表明，黑美人土豆黄酮提取物清除DPPH自由基能力优于芦丁小于VC；而清除ABTS自由基的能力和抗氧化力在质量浓度不高于20μg/mL时大于VC，但始终大于同质量浓度的芦丁；同质量浓度的黄酮提取物对ABTS自由基清除作用大于DPPH自由基，原因可能与提取物中黄酮的结构有关，以及提取物对不同体系的抗氧化作用不同[19]所致。黑美人土豆抗氧化的活性成分与黄酮有关外，其抗氧化还可能与醇提物中复杂的其它成分有关。至于抗氧化成分的种类、化学结构及其抗氧化机理有待进一步研究。

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Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from “Black Beauty” Potatoes

LI Cai-xia1,2，GAO Hai-ning1,2，JIAO Yang1,2，WU Dong-qing2,3，ZHANG Yong1,2,*，YANG Yan1
(1. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Universities, Hexi University, Zhangye 734000, China；3. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hexi University, Zhangye 734000, China)

The aim of this study was to investigate optimum condition for the extraction of flavonoids and the antioxidant activity of flavonoid extract. Temperature, solid-to-liquid ratio and ethanol concentration were identified as main variables that influence extraction efficiency and their optimum conditions were determined by response surface methodology to be 78 ℃, 1:35 (g/mL) and 62%, respectively. Under these conditions, the maximum predicted extraction yield of flavonoids was in good agreement with its experimental counterpart. The DPPH radical scavenging activity of the flavonoid extract obtained was stronger than that of rutin but weaker than that of VC. However, it exhibited ABTS radical scavenging activity and total antioxidant capacity that VC at the same concentrations lower than or equal to 20 μg/mL and rutin at the same concentrations lower than or equal to 25 μg/mL. These results demonstrate that flavonoids from “Black Beauty” potatoes have potent antioxidant activity and can be used as antioxidants and in functional foods.

“Black Beauty” potato；flavonoids；extraction process；antioxidant

R284.2

A

1002-6630(2013)04-0088-06

2011-11-06

民乐县科技局与河西学院合作项目(hxxy-ml001)；甘肃省高校研究生导师科研项目(1009-09)

李彩霞(1967—)，女，高级实验师，学士，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：lipeng@hxu.edu.cn

*通信作者：张勇(1963—)，男，教授，博士，研究方向为植物学与植物分子生物学。E-mail：zhangyong@hxu.edu.cn