纤维母细胞生长因子10基因在角膜混浊小鼠中的克隆测序与表达研究＊

吴刘成，张柳柳，李 瑶，王胜洁，季 韧，倪尧尉，邵义祥△

（1.南通大学比较医学研究所，江苏南通226001；2.南通大学医学院，江苏南通226001）

在哺乳动物正常发育过程中，眼睑生长覆盖眼睛、融合，而后重新开放。小鼠在正常发育过程中，胚胎期约11d开始出现原始的眼睑即单层细胞上皮，随着眼睑不断生长发育覆盖了角膜，约第16.5d眼睑上缘和下缘融合，完成胚胎期眼睑闭合，出生后约14d眼睑重新开放［1-2］。B6-Co（C57BL／6-corneal opacity）小鼠是通过乙基亚硝基脲（ENU）诱变技术获得并建立的出生时眼睑开放（EOB）突变系小鼠，出生后角膜逐渐混浊，角膜混浊发生率约为43.1%［3］，突变基因定位于13号染色体上60cM附近［4］。纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，Fgf10）基因突变小鼠也表现为出生时眼睑开放［5］，并且该基因位于突变基因定位区间。因此，本实验对该基因进行克隆测序分析，并利用实时荧光聚合酶链式反应（PCR）技术检测Fgf10基因的表达，探讨Fgf10基因与B6-Co小鼠EOB表型的关联，为研究人类遗传性眼睑缺陷形成机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验所用B6和B6-Co小鼠由南通大学实验动物中心提供，小鼠饲养在清洁级屏障动物房内，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2008-0010，使用许可证号：SYXK（苏）2012-0030。用B6与B6-Co小鼠交配，次日清晨检栓，妊娠16.5d，麻醉取胚胎。

1.2 主要试剂与仪器 Trizol、琼脂糖为加拿大BBI公司生产；逆转录试剂盒（RT）、Taq DNA Polymerase为加拿大Fermentas公司生产；引物合成、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒为生工生物（上海）股份有限公司生产；T载体试剂盒为美国Promega公司生产；TOP10感受态细胞、质粒小抽试剂盒为南京天根公司生产；EcoRⅠ为大连宝生物工程有限公司生产；荧光染料试剂盒为美国Biotium公司生产。超净工作台为苏净集团安泰公司生产；Centifuge 5417R冷冻离心机、Eppendorf AG 22331Hamburg PCR仪为德国Eppendorf公司生产；DYY-6B型稳压稳流电泳仪为北京市六一仪器厂生产；凝胶成像系统为江苏省捷达科技发展有限公司生产；Step One Real-Time PCR System为美国ABI公司生产。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 在Gene Bank中查找并下载Fgf10mRNA序列，以mRNA为模板设计部分引物，引物之间有重叠区域，Fgf10-a正向引物：5′-CAC CGT CCT GTC ATC TGT TT-3′，反向引物：5-TTC TTC TAT GTT TGG ATC GTC A-3′；Fgf10-3正向引物：5′-ATG GAA TCA AGT ATT ATC ACC-3′，反向引物：5′-AGT GTT TGC CAA GGT TTT-3′；Fgf10-c正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′；Fgf10-d正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反 向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′；Fgf10-e正向引物：5′-GCA CAA CCA AAG GAG C-3′，反向引物：5′-GAT CTA CAG AGC GAG GG-3′。设计实时荧光PCR引物，引物至少跨2个外显子，Fgf10正向引物：5′-TCC GCT GGA GAA GGC TGT-3′，反向引物：5′-CAA CTC CGA TTT CCA CTG ATG T-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，正向引物：5′-GGA GCG AGA CCC CAC TAA C-3′，反向引物：5′-GGC GGA GAT GAT GAC CCT-3′。

1.3.2 组织总RNA的提取和逆转录 剪取胚胎16.5dB6和B6-Co小鼠皮肤组织，放入匀浆器中，置于冰上，加入1mL TRizol，充分匀浆，按照试剂盒说明操作，最后用焦碳酸二乙（DEPC）处理水溶解获得RNA，核酸定量仪测定RNA浓度；按照RT试剂盒说明将RNA逆转录合成cDNA。

1.3.3 基因测序 PCR反应体系，10×PCR缓冲液 （buffer，含 Mg2＋）5.0μL，dNTP（10mmol／L）1μL，上游引物（50 μmol／L）0.5μL，下游引物（50μmol／L）0.5μL，模板cDNA 2.5ng，Taq DNA polymease（5U／μL）0.25μL，补灭菌去离子水至50μL。扩增条件，94℃5min；94℃1min，63℃30s；72℃30s，35个循环，72℃5min，根据引物熔解温度（Tm）值和扩增长度调整退火温度、变性时间及延伸时间。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，成像保存。PCR产物的纯化（胶回收），方法参照胶回收试剂盒进行。基因测序、回收产物与相应引物寄送上海生工生物股份有限公司测序。

1.3.4 基因的克隆测序 将发现突变的纯化PCR产物与T载体连接，2×buffer 5μL，目的DNA 1～3μL，T载体1μL，T4DNA Ligase 1μL，补灭菌去离子水至10μL，4℃ 过夜。取5μL链接产物和50～100μL感受态细胞加入预冷的离心管中；冰浴5min；42℃热休克90s；冰浴30min；加入200μL Luria-Bertani（LB）培养液，37℃，250r／min，振荡培养45min；取120～200μL菌液涂于1.5%琼脂LB平板（添加氨苄青霉素、β-半乳糖苷酶和异丙基硫代半乳糖苷）；37℃培养过夜；挑取白斑，扩培摇菌12～14h；提取质粒DNA分子；电泳检测；EcoRⅠ酶切释放目的片段，电泳检测，寄送上海生工生物股份有限公司测序。

1.3.5 实时荧光PCR 以GAPDH基因为内参，每个样品设置3个重复，反应体系为荧光染料预混液10μL，正、反引物各1μL，cDNA 1μL，补灭菌去离子水至20μL。反应条件，95℃4min；95℃20s，60℃20s，72℃30s并读取荧光值，45次循环，循环后设置55～90℃每隔0.3℃读荧光值生成熔解曲线。所有设定保存后运行程序。反应完成后，用相对定量分析方法分析各样品表达量。

1.4 统计学处理 PCR数据采用Stata7.0软件分析，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Fgf10基因测序及克隆测序结果 分别以表1中前5对引物对角膜混浊小鼠的基因进行扩增，从左向右依次电泳，得到大小不同的5个基因片段（图1A）。对以上5个片段割胶回收后分别进行测序，发现第4个片段基因有突变（图1B）。将第4个基因片段用T载体连接，对该基因片段进行克隆。通过蓝白斑筛选出重组质粒、质粒的鉴定，从上到下分别是开环质粒，环状质粒和超螺旋质粒，胶回收中间条带的环状条带（图1C）。重组质粒的EcoRⅠ酶切片段电泳图。限制性内切酶作用于重组质粒后，将环状重组质粒切成2个大小不同的片段，胶回收目的基因（图1D）。分离出目的基因，再对目的基因测序分析，并通过数据库比对发现在该基因第3外显子1 914bp和1 915bp之间插入碱基A（图1E）。

图1 Fgf10基因克隆测序流程图

图2 Fgf10基因扩增曲线和熔解曲线图

图3 实时荧光PCR检测Fgf10基因在B6-Co小鼠中的表达

2.2 荧光定量PCR分析结果 由图2可知，GAPDH、Fgf10 2个基因的扩增曲线均接近“S”型曲线，基因扩增效率良好；熔解曲线分析发现2个基因的PCR产物均呈较为锐利的单峰，无杂峰。Fgf10基因mRNA表达水平在B6-Co小鼠中明显低于B6小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

3 讨 论

眼睑是眼的门户，能够保护眼球避免受外伤与强烈光线刺激，协助瞳孔调节进入眼内光线，起到维持眼位及眼功能的作用；眼睑还与其他眼附属器一起共同发挥功能作用，保护角膜免受微生物感染。因此，眼睑发育缺陷将使眼的门户受损，调节和保护功能受限或缺失，导致各种眼部疾病［6-7］。人类遗传性眼睑缺陷并伴有其他眼部疾病是一种遗传性／先天性疾病，将有可能进一步造成严重的眼科疾病，如角膜炎、角膜感染、角膜混浊，重则致盲，现在临床多采用手术植皮的方法进行眼睑的修复，没有对应的动物模型可供研究。如何做到早期的诊断、预防和治疗，必须首先建立起研究技术平台，进行基础理论和实验技术的研究，建立可利用的动物模型深入进行研究是最佳途径。

小鼠胚胎眼睑闭合，是一个包括细胞增殖和迁移，细胞形态，牵涉许多生理和病理过程的动态发育过程［8］。绝大多数的哺乳动物的眼睑发育都要经历由融合至再分离的过程，并且这个过程能以相对恒定的程序发生。眼睑覆盖在眼球的前方，起保护眼球的作用，新生小鼠正常情况下眼睑闭合，若眼睑不能闭合，可能由于新生鼠抵抗力低，受外界病原体感染及异物刺激，引起角膜感染及角膜混浊。B6-Co小鼠眼睑发育缺陷导致角膜发育异常和先天性眼表疾病，该小鼠角膜混浊的病理过程呈典型的炎性反应，与人类角膜炎的病理变化过程相似［9］，值得进一步研究开发其价值。

Fgf10缺失小鼠在出生时表现出眼睑开放并伴有多器官发育缺陷［10］。Jin等［11］已经证实Fgf10通过调节表皮生长因子受体（EGFR）信号通路来促进细胞增殖和迁移以促进眼睑的发育。还有研究表明，Fgf10的功能可能是调节细胞骨架的活性和基因转录，在小鼠眼睑发育中，可能与Wnt信号通路调节有关［12］。通过分离和培养野生型和Fgf10缺陷型胚胎眼睑的角质形成细胞，行体外划痕实验，证明小鼠眼睑上皮细胞的增殖、迁移能力受到严重阻碍，从而导致新生小鼠眼睑上下缘周皮的完整性存在缺陷，Fgf10信号中断也使得激活素βB和Tgfa下调，且延迟了声音刺猬（Shh）蛋白的表达［13］。

有研究表明，基因的编码区或非编码区发生点突变后，可以使机体产生某种疾病［14-15］。本实验对该基因进行了PCR扩增，通过克隆测序发现在Fgf10基因第3外显子1 914bp和1 915bp之间插入碱基A（图1），位于3′末端非编码区。为进一步了解该突变基因在B6-Co小鼠中的作用，采用实时荧光PCR技术检测Fgf10基因的表达变化，结果表明该基因在B6-Co小鼠胚胎E 16.5d的表达明显下调（P＜0.05）（图3），提示该突变位点可能影响了其基因的表达，或直接影响了功能蛋白质的翻译与剪接，是否B6-Co小鼠中存在其他突变基因而影响了Fgf10基因的表达调控也值得深入探讨。作用于基因表达调控的因素很多，其具体机制需进一步深入研究，从而为人类眼科类疾病的诊断、治疗及预防提供参考依据。

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