永川地区慢性乙型肝炎患者病毒基因分型及耐药性研究＊

代红莹，王世伟，朱天金，王 科

（重庆医科大学附属永川医院：1.检验科，2.感染科 402160）

乙型病毒性肝炎（简称乙肝），是由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。2010年版慢性乙型肝炎防治指南指出慢性乙型肝炎治疗的总体目标是：最大限度地长期抑制HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、肝癌及其并发症的发生［1］。循证医学研究表明长期使用核苷（酸）类似药物可能导致HBV基因产生耐药性突变，从而导致病情反复或反弹［2-3］。本研究通过分析永川地区乙型肝炎患者治疗过程中的乙型肝炎耐药情况，对了解该地区乙型肝炎病毒分型，减少HBV变异和耐药的产生，指导临床合理治疗乙型肝炎具有重要意义［4］。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2011年1月至2012年12月间来本院门诊和住院的慢性HBV感染者共605例，其中男379例，女226例，年龄15～65岁，诊断按照慢性乙型肝炎诊断（2010版）［1］的诊断标准，所有病例其他类型的肝炎病毒（甲、丙、丁、戊、庚）均为阴性，所有样本收集均征得患者同意，并与患者签订了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 静脉采集慢性乙型肝炎患者不抗凝血3 mL，2 000r／min，离心5min，分离血清置1.5mL EP管中，-20℃储存备用。

1.2.2 荧光定量PCR检测 循环参数设定：尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）反应50℃，2min；Taq酶活化94℃，2min；变性94℃，10s；退火；延伸及荧光采集60℃，30s；PCR仪冷却35℃，10s；详细操作按荧光定量试剂盒说明书。HBV DNA定试剂盒量（上海科华生物工程股份有限公司），荧光定量PCR仪（上海宏石有限公司）。

1.2.3 基因芯片反向斑点杂交检测 HBV DNA耐药基因芯片试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司），FYY-3型分子杂交仪（兴化市分析仪器厂），PCR扩增仪（中国杭州博日有限公司），HBV DNA提取及扩增、杂交条件的具体操作按说明书。根据显色（蓝色斑点）出现的阵列位点直接判读HBV的基因型和耐药突变类型。

1.2.4 血清标志物检测 乙型肝炎病毒血清标志物和甲、丙、戊、庚型肝炎病毒抗体检测试剂盒由厦门新创公司提供，具体操作按照说明书。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行数据处理，计量资料以±s表示，采用t检验进行单因素统计学分析，率的比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 慢性乙型肝炎患者HBV基因分型情况 605例慢性乙型肝炎患者中，B型基因型382例（63.1%），C型基因型189例（31.2%），B、C混合基因型18例（3.0%），D 基因型9例（1.5%），B、C、D以外的其他基因型7例（1.2%）。B型慢性乙型肝炎患者所占百分比明显高于C型，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 慢性乙型肝炎患者HBV B、C、D基因型耐药情况 605例慢性乙型肝炎患者中，516例对拉米夫定敏感，35例对拉米夫定耐药，57例对阿德福韦酯耐药，23例表现为多重耐药性。57例对阿德福韦酯耐药的突变基因型中，耐药基因型表现为B型基因型和C型基因型为主，B、C混合型与其他型未见耐药，其突变基因型以236T为主，且多见于B基因型，B型236T基因突变型为35.09%，B型基因型和C型基因型的236T基因突变型为50.80%，见表1。35例对拉米夫定耐药，耐药以B、C型基因型为主，其他型未见耐药。其突变基因型以rt108M为主，且多见于B基因型。B型rt108M基因突变型为34.29%。B型基因型和C型基因型的rt108M基因突变型为48.57%，见表2。

表1 HBV B、C基因型与阿德福韦酯耐药变异类型的关系［n（%）］

表2 HBV B、C基因型与拉米夫定耐药变异类型的关系［n（%）］

2.3 HBV耐药患者乙型肝炎DNA复制数与未发生HBV耐药DNA复制数关系 临床上应用核苷（酸）类药物治疗出现耐药的116例患者，常见耐药位点为：rta181V、rt236T、rt204V、rt180M，患者发生乙型肝炎耐药后HBV病毒（7.08±4.12）×106copy／mL，而未发生乙型肝炎耐药后 HBV病毒（6.08±3.52）copy／mL，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

目前，HBV可分为A～I基因型。HBV基因型分布有明显地域性，文献报道国内HBV基因型以B型、C型和D型为主。HBV基因型分布在中国存在明显地区和民族差异。北方以C型为主，南方以B型为主，汉族以B、C为主，D型少见。经对永川地区乙型肝炎患者的HBV基因型分析发现，在605例慢性乙型肝炎患者中，B基因型382例（63.1%）；C基因型189例（31.2%）；B，C混合基因型18例（3.0%）；D基因型9例（1.5%）；B，C，D以外的其他基因型7例（1.2%）。结果表明：HBV基因型以B型为主，C型较少，与目前文献报道比较一致［5-6］。本研究在对乙型肝炎耐药性研究的同时采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测其他肝炎病毒血清学指标，有效保证患者为单纯乙型肝炎病毒感染引起慢性乙型肝炎，只有其他类型的肝炎病毒（甲、乙、丙、丁、戊、庚）均为阴性的患者才能作为研究纳入研究对象，这样可防止临床并发其他病毒感染患者对实验的干扰。

拉米夫定是最早被用于乙型肝炎抗病毒治疗药物［7］，其主要是通过抑制乙型肝炎DNA的合成发挥作用，拉米夫定的耐药突变位点主要集中在逆转录酶C区上的YMDD基因序列与保守B区（主要包括rt108M、rt204V、rt204I3个突变位点），由于拉米夫定使用早，易发生突变，临床已不常使用［8-10］。本研究发现永川地区乙型肝炎耐药主要表现为对阿德福韦酯耐药，这可能与临床医生广泛使用阿德福韦酯治疗乙型肝炎有关。阿德福韦酯作为一种腺苷酸的类似物，具有广谱抗病毒特点，其主要通过竞争性的抑制dATP结合到病毒DNA上，从而阻止病毒DNA的合成。阿德福韦酯耐药突变主要表现为HBV逆转录酶B区的rtA181V和D区的rt236T［11］。57例对阿德福韦酯耐药的突变基因型中，表现为B和C基因型出现耐药（38例为B型，19例为C型），B，C混合型与其他型未见耐药。突变基因型以236T为主，未检测出207I突变基因型。研究还表明：永川地区B型较C型更容易对阿德福韦酯产生耐药，临床乙型肝炎患者一旦发生HBV耐药后病毒复制相数对较高，而未发生耐药患者，病毒复制数普遍偏低，提示：慢性乙型肝炎患者治疗过程要重视HBV耐药性发生，加强对乙型肝炎治疗效果的评估，建议临床医生在乙型肝炎治疗过程中密切关注病毒复制和耐药情况。一但发生耐药要及时调整治疗方案，如对于拉米夫定、恩替卡韦发生耐药者，可加用阿德福韦酯联合治疗。对于阿德福韦酯耐药者，可加拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦联合治疗，以提高治疗效果［12-13］。

HBV耐药基因检测方法主要有质谱分析法、限制性片段长度多态法、线性探针分析法、荧光定量PCR熔解曲线分析法、基因芯片技术等［14］。本研究采用PCR扩增法和DNA反向斑点杂交相结合的基因芯片技术，可一次性检测HBV 3种常见基因型（B、C、D型）及对临床上所用药物拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦等常见耐药相关点的突变检测。该法准确度高、灵敏高和特异性好、检测速度快，值得在临床广泛推广使用［15］。

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