二苯乙烯苷对小鼠肝细胞色素P450的影响＊

张 锋，刘 航，王艳英，聂 晶，陆远富，石京山

（遵义医学院药理学教研室暨贵州省基础药理重点实验室，贵州遵义563099）

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）属于药物代谢的第一相酶，主要存在于肝脏微粒体中，在药物生物转化中发挥非常重要的作用。大量的研究证实CYP被激活或被抑制是引起药物相互作用和导致药物不良反应增加或疗效降低的重要原因［1］。因此，在临床联合用药时，研究药物对CYP的影响，对于评估其他药物在体内的血药浓度水平可能的改变方向具有指导意义。二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbene glucoside，TSG）是何首乌的主要药效成分之一［2］。研究发现，TSG具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力、调节血脂、抗动脉粥样硬化、提高学习记忆力、抗炎、抗肿瘤及保肝等作用［3］。鉴于TSG的药理作用广泛，与其他药物联合应用潜在机会较多，本研究拟采用实时逆转录PCR（real time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）探讨TSG对小鼠肝组织微粒体CYP的影响，以期为临床合理用药提供基础药理学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠，体质量20～24g，购自第三军医大学动物实验中心，许可证号为SCXK-（军）2012-0410。

1.2 仪器与试剂 TSG（C20H22O9相对分子质量406，纯度大于98%，批号：110844200607）购自中国药品生物制品检定所；RNA提取试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；RNA逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；所有引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RNA逆转录仪购自德国Eppendorf公司；RT-PCR扩增仪购自美国BIO-RAD公司；紫外分光光度计（型号TU1810）购自北京谱析仪器公司；电子分析天平购自北京赛多利斯电子有限公司；高速冷冻离心机购自德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.2 实验分组和给药 昆明种雄性小鼠45只分为3组：空白组、TSG低剂量组（10mg／kg）、TSG高剂量组（40mg／kg），每组15只；后两组组每天灌胃给予TSG溶液，空白组灌胃给予药物等体积的生理盐水。

1.3.2 RT-PCR检测 药物灌胃3、5、7d后分别用10% 水合氯醛麻醉小鼠，固定，剪开腹腔取肝脏于总RNA提取试剂（Trizol）液中匀浆，根据逆转录试剂盒说明书，首先提取总RNA，逆转录合成第1链互补cDNA，通过特异性引物对小鼠肝组织中的CYP1A2、CYP2B10、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A11、CYP3A25、CYP4A14和内参基因β-actin进行扩增［4］，基因引物序列为：β-actin上游：3′-TCG TAC CAC TGG CAT TGT GA-5′，下游：3′-TCC TGC TTG CTG ATC CAC AT-5′；CYP1A2上游：GCC TGA GAT ACA GAG GAA GATCCA-5′，下游：3′-GGC ACA TAA CAG GTG TTT GTA GAC T-5′；CYP2B10上游：3′-AAG GAG AAG TCC AAC CAG CA-5′，下 游：3′-CTC TGC AAC ATG GGG GTA CT-5′；CYP2E1上游：3′-GGC ACC ATG TCT GCC CTC GG-5′，下游：3′-CCT CCA CAC ACT CAT GAG CG-5′；CYP3A4上游：3′-AAC TTT GGC ATT GAA CAG CA-5′，下 游：3′-GGA TGC AGG GAT GAT GAC TA-5′；CYP3A11上游：3′-CTC AAT GGT GTG TAT ATC CCC-5′，下游：3′-CCG ATG TTC TAA TGC C-5′；CYP3A25：上游：3′-AGT ACT GGC CAG AGC CTC AA-5′，下游：3′-TCG TTC TCC TTG CTG AAC CT-5′；CYP4A14上游：3′-CGA CTC GAT CCA GAA ACT AC-5′，下游：3′-ACA GGA CAC ATT GCA GAG AG-5′。

表1 TSG对小鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和CYP4A14mRNA表达的影响（±s，n＝5）

表1 TSG对小鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4和CYP4A14mRNA表达的影响（±s，n＝5）

a：P＜0.05，与空白组比较；b：P＜0.05，与 TSG高剂量组作用7d时比较。

3d 5d 7d CYP1A2 空白组基因 组别160.49±37.47 128.33±17.03 137.07±13.40 TSG低剂量组 94.85±28.08a 77.52±36.03 86.45±29.35 TSG高剂量组 108.20±17.59a 59.63±13.60a 87.60±19.41a CYP2E1 空白组 85.58±25.41 72.41±29.07 86.95±48.30 TSG低剂量组 86.06±28.90 78.46±17.15 139.47±44.96 TSG高剂量组 140.37±22.54ab 190.62±34.63ab 284.05±72.83a CYP3A4 空白组 91.01±14.14 134.23±35.98 174.51±44.49 TSG低剂量组 140.59±38.17 100.69±41.58 187.18±70.91 TSG高剂量组 46.49±13.75a 44.53±12.71a 29.62±11.88a CYP4A14 空白组 169.34±42.28 116.48±39.03 164.49±17.11 TSG低剂量组 119.96±18.04 52.40±30.29 150.06±29.27 TSG高剂量组 109.87±38.18 78.75±32.21 87.31±26.61a

表2 TSG对小鼠肝脏CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表达的影响（±s，n＝5）

表2 TSG对小鼠肝脏CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表达的影响（±s，n＝5）

3d 5d 7d CYP2B10 空白组基因 组别57.73±33.28 132.36±56.41 207.31±46.03 TSG低剂量组 78.33±31.15 136.16±49.03 170.29±29.19 TSG高剂量组 66.43±9.18 89.29±38.09 156.03±28.24 CYP3A11 空白组 187.31±49.78 122.65±27.53 123.22±46.43 TSG低剂量组 171.22±39.64 77.06±29.45 120.16±34.88 TSG高剂量组 115.96±53.13 109.68±18.98 202.31±47.21 CYP3A25 空白组 177.90±55.34 73.33±36.24 135.59±41.24 TSG低剂量组 134.54±37.75 40.42±34.01 166.22±63.21 TSG高剂量组145.08±35.53 71.52±41.25 190.56±68.14

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TSG 对 小 鼠 肝 脏 CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4 和CYP4A14表达的影响 与空白组比较，TSG高剂量作用3、5、7d后均能够抑制CYP1A2mRNA的表达，而TSG低剂量作用3d能够抑制CYP1A2mRNA的表达；TSG高剂量作用3、5、7d后呈时间依赖性的增加CYP2E1mRNA的表达，TSG低剂量对CYP2E1mRNA的表达无显著影响；TSG高剂量作用3、5、7d后均能够显著抑制CYP3A4mRNA的表达，TSG低剂量对CYP3A4mRNA的表达未见明显作用；TSG低剂量和高剂量分别作用3、5d后对CYP4A14mRNA的表达无显著影响，而TSG高剂量作用7d后能够显著抑制CYP4A14 mRNA的表达，见表1。

2.2 TSG对小鼠肝脏CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25mRNA表达的影响 与空白组比较，TSG低剂量和高剂量分别作用3、5、7d后对 CYP2B10、CYP3A11和 CYP3A25mRNA 的表达无显著性影响，见表2。

3 讨 论

药物在体内的过程受到多种因素的共同调节与影响。药物代谢酶系统与转运体都是影响药物代谢动力学过程的关键因素。细胞色素P450是以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶，其主要功能是对药物和部分致癌物质进行生物转化［5］。药物的专属代谢酶能够被同时应用的其他药物诱导或抑制，通过药物之间的代谢性相互作用导致组织或血液中的底物或代谢产物浓度升高或降低，甚至引起毒性物质在体内的蓄积，从而影响临床用药的疗效和安全性［6-7］。

CYP1A、CYP2E和CYP3A是CYP酶系中重要的药物代谢酶，调控大多数临床药物的代谢。CYP1A2是CYP1A中最重要的亚家族，其含量约占肝脏CYP总量的13%。研究发现CYP1A2在咖啡因、非那西汀、维拉帕米、对乙酰氨基酚、普萘洛尔、丙咪嗪以及硝苯地平等20余种药物的代谢中发挥重要作用［8-9］。此外，CYP3A亚家族中CYP3A4是成人肝脏中最重要的成分，约占CYP总量的40%，能催化代谢60%以上的临床治疗药物，如可的松、红霉素、卡马西平、咪达唑仑、利多卡因、奥美拉唑、雌二醇、辛伐他汀等［10-11］。本研究发现，TSG能够抑制CYP1A2和CYP3A4基因表达，表明TSG在与经CYP1A2和CYP3A4代谢的药物联合用药时，可能会减慢对其他药物的代谢，应适时调整联合用药的给药剂量，避免因为药物之间的代谢性相互作用引起药物蓄积，从而影响药物的疗效和安全性。

CYP2E亚家族中尤其以CYP2E1最为重要，CYP2E1约占肝脏CYP总量的7%，目前已经确定的CYP2E1的底物已达70多种，如醋氨酚、乙醇、吸入性含氟麻醉剂、茶碱、工业和家庭常用的芳香族类化合物等，这些物质在体内经CYP2E1催化后可氧化生成毒物或致癌物质，从而严重影响药物的疗效和增加不良反应的发生［12-14］。本研究发现TSG能够诱导CYP2E1基因表达，提示TSG与其他通过CYP2E1代谢的药物联用时，很可能会导致其他药物代谢加快，进而影响药物疗效。

值得一提的是，本研究发现TSG对CYP4A14基因表达具有抑制作用。新近研究发现，CYP4A14的表达增加与脂质过氧化损伤程度密切相关，通过造成体内氧化-抗氧化水平失衡，进而导致肝内氧化应激反应，产生大量活性氧自由基和脂质过氧化物，从而引起肝脏炎症反应［15-17］。本研究发现TSG能够抑制CYP4A14基因表达，提示TSG可能影响肝脏内的脂质过氧化反应，其具体作用机制值得进一步的探讨。

综上所述，本实验发现TSG对CYP1A2、CYP3A4以及CYP4A14基因表达具有抑制作用，对CYP2E1基因表达具有诱导作用，对CYP2B10、CYP3A11和CYP3A25基因表达无显著性影响。本研究初步评价了TSG对小鼠CYP亚家族基因表达的影响，为其在临床应用中产生相互作用的可能性提供了依据，但有关TSG对CYP酶活性影响具体机制还有待进一步的研究。

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