肝细胞癌患者血清m iR-221和m iR-122的检测及其临床意义

雷永红，吕文平，王 海

（1.解放军总医院海南分院住院病案管理科，海南三亚572000；2.解放军总医院肝胆外科，北京100853；3.解放军总医院海南分院检验中心，海南三亚572000）

·论 著·

肝细胞癌患者血清m iR-221和m iR-122的检测及其临床意义

雷永红1，吕文平2，王 海3

（1.解放军总医院海南分院住院病案管理科，海南三亚572000；2.解放军总医院肝胆外科，北京100853；3.解放军总医院海南分院检验中心，海南三亚572000）

目的探讨检测血清RNA中miR-221和miR-122在肝细胞癌患者血清中的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量逆转录－聚合酶链反应（reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR）对比检测72例肝细胞癌患者、48例肝良性疾病患者和60例正常对照组人员血清中miR-221和miR-122水平。分析miR-221和miR-122的表达程度与患者临床病理参数的关系。结果肝细胞癌患者血清miR-221和miR-122明显高于良性肝病和正常对照组（P＜0.05）。肝癌患者血清miR-221和miR-122表达的高低与肝硬化、甲胎蛋白、肿瘤大小、病理分化、临床病理TNM分级有关（P＜0.05）。结论血清miR-221和miR-122与肝癌的临床病理特征关系密切，可能是肝细胞癌新的早期检测指标。

肝肿瘤；血清；微RNAs

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症病死率中居第3位。早期发现和诊断HCC成为目前治疗的关键［1］。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平的测定是目前最常用的诊断肝细胞癌血清学指标，但临床上仍

有约30％HCC患者血清AFP含量在正常范围内，临床上极易漏诊［2－3］。因此，临床科研人员一直试图寻找新的肿瘤标志物来辅助诊断。miRNA是近年来发现的一类长度20～25nt的非编码调控单链小分子RNA，它通过与其目标mRNA分子的3＇UTR完全或不完全互补匹配，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。miRNA调控细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生理病理过程［4－6］。最近的研究［7－9］表明，miR-221和miR-122的表达在HCC患者癌组织和血清中会出现明显的变化，而这种变化与HCC的发生关系密切。本文通过检测HCC患者血清miR-221和miR-122表达水平，探讨miR-221和miR-122在HCC诊断和治疗中的应用价值。

1 资料与方法

1．1 一般资料：收集解放军总医院2010年8月—2011年6月接受手术治疗的72例肝癌患者血清样本。所有患者均经过术后病理学证实，其中男性48例，女性24例，年龄25～68岁，平均47.2岁。另取48例肝良性病（肝血管瘤16例，肝囊肿23，肝腺瘤9例，男性30例，女性18例，年龄34～62岁，平均44.7岁）和60例正常人（男性37例，女性23例，年龄35～58岁，平均45.6岁）血清作为对照。所有血清标本立即放入液氮中冻存并于－80℃冰箱保存。

1．2 分离收集血清：空腹采集静脉血3mL，将其置于室温下1h。然后2 000r/min离心15min，取上清（血清）置于新1.5mL微量离心管。置于－80℃冰箱待测。

1．3 总RNA的提取：采用Trizol法提取血清总RNA。NanoDrop®ND-1000测定RNA浓度并评估纯度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。将提取出的RNA样品保存于－80℃冰箱以备下一步实验使用。

1．4 miRNA的cDNA合成：制备RT混合反应液，Total RNA 0.3μg，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L each）2μL，10×RT Buffer 2μL，RT特异引物（1μmol/L）0.5μL，MMLV反转录酶（10U/uL）2μL，RNA酶抑制剂（40U/μL）0.3μL，加入无RNA酶水至总体积20μL。在Gene Amp PCR System 9700进行RT反应，16℃，30min；42℃水浴，40min；85℃水浴，5min反应结束后，冰上冷却5min，－20℃保存。

1．5 Realtime PCR反应：以U6为内参基因，采用10μL的反应体系，PCR引物序列见表1。dNTP（2.5mmol/L each）1.0μL，10×PCR缓冲液1.0μL，MgCl2溶液0.6μL，Taq聚合酶0.5U，Sybergreen I终浓度0.25×，10μmol/L PCR特异引物F 0.4μL，10μmol/L的PCR特异引物R 0.4μL，2×ROX Reference Dye 0.2μL。反应条件，95℃，3min；40个PCR循环（95℃，15s；60℃，30s；72℃，30s），重复3次。数据采用2－ΔΔCT法（CT值定义为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）分析miR-221和miR-122表达的相对变化。

表1 Real time RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for real-tim ePCR analysis

1．6 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据处理。计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 HCC患者与肝良性病、正常人血清miR-221和miR-122的表达水平：以U6为内参基因，HCC患者血清中miR-221和miR-122的表达水平（分别为10.58±3.47、2.3±1.09）较肝良性病（1.34±0.53、0.81±0.33）和正常人（1.29±0.32、0.78±0.31）明显上调（P＜0.01）。而miR-221和miR-122在肝良性病和正常人血清中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

2．2 血清miR-221和miR-122与HCC临床病理特征间的关系：HCC患者血清miR-221和miR-122的表达水平与肿瘤的大小、术前AFP水平、肝硬化、病理分化、癌栓、TNM分期有关（P＜0.05），而与患者的性别、年龄无明显关系（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理指标的HCC患者血清m iR-221和m iR-122表达水平Table 2 Serum m iR-221 and m iR-122 of HCC patients w ith different clinical and pathologic features ±s）

表2 不同临床病理指标的HCC患者血清m iR-221和m iR-122表达水平Table 2 Serum m iR-221 and m iR-122 of HCC patients w ith different clinical and pathologic features ±s）

t P Gender Male Female Clinical and pathologic features n miR-221 t P miR-122 0.715＞0.05 Age（years）＜50≥50 48 24 10.40±3.25 10.64±3.13 0.725＞0.05 2.31±1.04 2.26±1.09 33 39 10.36±3.27 10.59±3.41 0.963＞0.05 2.28±1.08 2.34±1.11 0.844＞0.05 Tumor size≤5cm＞5cm 40 32 13.19±4.48 2.518＜0.05 1.27±0.64 3.57±1.37 3.062＜0.05 8.85±2.76 Tumor grade Well differentiated Moderately differentiated Poorly differentiated 30 28 14 8.43±3.29 9.77±3.73 16.28±5.84 2.154＜0.05 1.82±0.69 2.08±0.91 3.83±1.74 2.013＜0.05 Hepatic cirrhosis Positive Negative 41 31 11.72±3.63 9.65±3.41 2.385＜0.05 3.06±1.45 1.38±0.59 3.147＜0.05 Preoperative levels of afp（μg/L）＜20≥20 18 54 11.25±4.76 2.549＜0.05 2.09±1.05 2.42±0.93 2.238＜0.05 7.95±3.39 TNM stageⅠⅡⅢ23 38 11 7.34±2.95 10.34±4.84 16.70±7.26 2.487＜0.05 1.43±0.66 2.53±1.07 3.71±1.78 2.870＜0.05 Cancer embolus Positive Negative 23 49 12.08±5.52 9.69±4.03 2.307＜0.05 3.25±1.62 1.92±0.83 2.931＜0.05

2．3 血清miR-221和miR-122在HCC中的诊断价值：以健康人血清miR-221和miR-122检测值的±2s作为正常人的临界值（cut-off值）。miR-221诊断HCC的敏感度为87.22％，特异度为78.05％，准确度为85.47％；而miR-122诊断HCC的敏感度为80.71％，特异度为88.16％，准确度为83.69％。

3 讨 论

miRNA与肿瘤的发生和发展有着极为密切的关系，在肿瘤中的miRNA表达往往具有组织特异性。外周血中含有丰富的稳定表达的miRNA。且血清miRNA由于其内源性的结构特性决定了其具有对抗核糖核酸酶的能力，且在经历反复冻融、pH值改变等情况下，其表达仍能维持稳定［10］。新的研究［11－13］发现，一些肿瘤相关的miRNA在肿瘤患者血清中出现异常变化，而且这种改变与肿瘤的发生、发展、复发、转移以及预后密切相关。因此，推测miRNA可能是一个理想的基于血液的肿瘤检测评估指标及治疗靶点。

miR-122是肝脏中特异性高表达的一种miRNA，其前体定位于人类18号染色体18q21.31上［14］。生理状态下，miR-122在调控肝脏的细胞发育、诱导细胞分化、调节细胞代谢、参与肝细胞应激应答等生命活动过程中发挥重要作用。肝癌细胞中miR-122的表达明显下调，其在肝癌的发生发展中表现出抑癌基因的功能。Igf1R、ADAM-10、Bcl-w、Cyclin G1、Wnt1、β-catenin和TCF-4等致癌基因被证实为miR-122的下游靶基因，通过人工上调miR-122的表达则能明显抑制肝癌细胞的生长和转移［15－17］。肝癌患者血清中的miR-122的表达却是明显升高的，这种反常性的升高可能与恶性肿瘤对肝脏造成的损害有关，并且其表达水平与患者的预后密切相关，提示血清miR-122检测是诊断PHC较为有效的方法［9］。

miR-221是新近发现的一种miRNA。其基因定位于X染色体P11.3区约1 kb的区域内。有研究［18－20］表明，miR-221在许多恶性肿瘤细胞（如肝癌、胃癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌等）中的表达明显上调，表现为一种“通用”的促癌基因。其机制可能通过对p27、CDKN1C/p57、PUMA、Bm f、c-kit、DDIT4等基因的调控来调节细胞周期和分化，抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤的发生发展。尤其值得关注的是，肝癌患者血清中miR-221的表达上调，而这种改变与肝癌的临床病理特征、患者的总体生存率有关［8］。

本研究采用Realtime PCR技术对72例HCC患者血清中miR-221和miR-122的表达情况，并与48例肝良性病、60例正常人血清进行对比。结果显示HCC患者血清miR-221和miR-22的表达水平明显高于肝良性病和60例正常人。与HCC临床病理因素分析显示，血清miR-221和miR-122的表达水平与患者的性别、年龄无明显关系，而与与肿瘤大小、肝硬化、肿瘤分化、术前AFP水平、癌栓、TNM分期相关，这与文献报道一致［8－9］。提示血清miR-221

和miR-122的高表达与HCC的发生发展相关，也间接提示其可能与HCC癌的不良预后有关，但这需要大样本研究和长时间的随访才能得到证实。目前尚无正常人血清miR-221和miR-122 cut-off值。我们以健康人血清miR-221和miR-122检测值的±2s作为正常人的cut-off值。结果显示miR-221诊断HCC的敏感度为87.22％，特异度为78.05％，准确度为85.47％；而miR-122诊断HCC的敏感度为80.71％，特异度为88.16％，准确度为83.69％。表明血清miR-221和miR-122在早期诊断HCC方面具有的优势和潜力［21］。

然而，目前血清miR-221和miR-122作为HCC检测标记物尚处于早期研究阶段，还存在一些亟待解决的问题：①目前血清miRNA的检测尚需标准化；②miRNA作为HCC血清标志物，其参考值范围还需进一步论证；③临床试验样本量普遍较少，缺乏长期追踪随访资料。

总之，miR-221和miR-122是新发现的肝肿瘤标志物，其血清表达水平与HCC的临床病理特征关系密切。随着对miRNA在癌症发生发展过程中的作用更深入的了解，临床上对于血清miRNA的检测不仅可以提高肝脏癌变的早期诊断，也可以通过anti-miRNA寡核苷酸、miRNA海绵、miRNA模拟物等途径调控体内肿瘤相关miRNA的表达，可能成为一种治疗癌症的新途径［22］。

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（本文编辑：赵丽洁）

DETECTION OF m iR-221 AND m iR-122 IN SERUM OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA PATIENTS AND CLINICAL SIGNIFICANCE

LEIYonghong1，LVWenping2，WANG Hai3
（1．Department of Inpatients＇Medical Record，Hainan Branch Affiliated to General Hospital of PLA，Sanya 572000，China；2．Department of Hepatobiliary Surgery，PLAGeneral Hospital，Beijing 100853，China；3．Inspection
Center，Hainan Branch Affiliated to General Hospital of PLA，Sanya 572000，China）

Objective To investigates the expression of miR-221 and miR-122 in serum of hepatocellular carcinoma（HCC）patients，as well as their clinical significance.MethodsThe blood samples were collected from 72 patients with HCC，48 patients with benign disease and 60 normal subjects.The expression levels of miR-221and miR-122 in the serum were measured by reverse transcription polymerase chain reaction.The correlations of miR-221and miR-122 expression to the clinicopathological featureswere analyzed.ResultsHCC patients had significantly highermiR-221 and miR-122 levels than benign diseases and healthy controls.The expression level of serum miR-221 and miR-122 had a close correlation with liver cirrhosis，alpha fetoprotein level，tumor size，tumor thrombi，histological differentiation，tumor nodemetastasis classification（P＜0.05）.ConclusionThe expression of miR-221 and miR-122 in serum had close correlations with the clinicopathologic features of hepatocellular carcinoma，indicating that miR-221 and miR-122 can be used as potential markers for HCC.

liver neoplasms；serum；microRNAs

R735.7

A

1007-3205（2013）05-0522-04

2013－03－18；

2013－04－01

国家自然科学基金项目（30772493）

雷永红（1967－），女，河北曲阳人，解放军总医院海南分院主管技师，医学学士，从事住院病案管理研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.010