二十九味能消散质量标准研究

魏永义 邵成雷 马宏伟

山东阿如拉药物研究开发有限公司，山东 济南 250101

二十九味能消散质量标准研究

魏永义 邵成雷 马宏伟

山东阿如拉药物研究开发有限公司，山东 济南 250101

目的：建立二十九味能消散的质量控制方法。方法：采用TLC对二十九味能消散中肉豆蔻、乳香、大黄、胡椒碱进行了定性鉴别；采用高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量。结果：薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰，专属性强；红花中羟基红花黄色素A的线性范围为10.78～107.8 g，r＝0.9998，平均加样回收率为98.37%，RSD为1.17%（n＝6）。结论：本研究建立的薄层色谱方法及高效液相色谱法专属性强、准确度高、重现性好，可用于二十九味能消散的质量控制。

二十九味能消散；羟基红花黄色素A；HTC；HPLC；质量标准

二十九味能消散记载于 《藏医临床札记》中，作者云丹嘉措是十三世纪的著名藏医，他经多年临床实践总结，在前人方剂的基础上炮制出二十九味能消散。因其对妇女子宫肌瘤和卵巢囊肿的良好疗效，被历代藏医学家所推崇。二十九味能消散由藏木香、寒水石 （煅）、诃子、小米辣、碱花、肉豆蔻、荜茇、大黄、铁棒锤、红花、木香马兜铃、黄葵子等29味药组成的，具有祛寒化痞、消食、调肝益肾的作用。主要用于食积不化，胃肠肝区疼痛，肾病，肠病，中毒，肝病，子宫病，黄水散入脉道，胃肠痞病，胆痞病，风寒引起的痞瘤等［1］。

二十九味能消散收载于国家药品标准，标准编号：WS3－BC－0140－95。原标准无定性鉴别和定量检测项，为了更好的控制其质量，本文建立了肉豆蔻、乳香、大黄、胡椒碱的薄层色谱鉴别方法，并用高效液相色谱法对红花中的羟基红花黄色素A进行了含量测定。经试验证明，该方法专属性强，准确度高，重现性好，可用于二十九味能消散的质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 L－2100型日立高效液相色谱仪（日立公司）；AUW220D电子天平（岛津公司）；HH－4数显恒温水浴锅（常州荣冠试验分析仪器厂）；101型电热鼓风干燥箱 （北京市永光明医疗仪器厂）；ZF－2型三用紫外仪 （上海安亭电子仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

1.2 试药 乳香对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120970－200904）；大黄对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120902－200408）；胡椒碱（中国药品生物制品检定所，批号：0775－200203）；肉豆蔻对照药材（中国药品生物制品检定所，批号：120926－200903）；羟基红花黄色素A（中国药品生物制品检定所，批号：111637－200905）；二十九味能消散（青海金诃藏药药业股份有限公司，批号：20110815、20110816、20110817）；阴性对照样品自制，所用药材均符合 《中华人民共和国药典》 （2010年版·一部）有关要求；硅胶G薄层板 （青岛海洋化工厂分厂）；高效液相色谱法所用甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 乳香的鉴别［2］取本品粉末3g，加乙醚30m l，超声处理15min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取乳香对照药材0.5g，加乙醚30ml，超声处理15min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2m l使溶解，作为对照药材溶液；另取按处方比例配制缺乳香的阴性样品3g，加乙醚30m l，超声处理15min，滤过，滤液挥干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为阴性对照溶液；照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯－醋酸乙酯 （8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干。喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图1。

2.1.2 大黄的鉴别［3］取本品粉末3g，加甲醇30m l，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入盐酸1ml，水浴回流30min，冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为供试品溶液；另取大黄对照药材0.5g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10m l使溶解，加入盐酸1ml，水浴回流30min，冷却，用乙醚提取2次，每次10m l，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2m l使溶解，作为对照药材溶液；另取按处方比例配制缺大黄的阴性样品3g，加甲醇30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加入盐酸1ml，水浴回流30min，冷却，用乙醚提取2次，每次10ml，合并乙醚液，挥干，残渣加三氯甲烷2ml使溶解，作为阴性对照溶液；照薄层色谱法 （《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以正己烷 －醋酸乙酯 －甲酸（6∶2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图2。

2.1.3 胡椒碱的鉴别［4］取本品粉末3g，加醋酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取胡椒碱适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的对照品溶液；另取按处方比例配制缺荜茇、胡椒的阴性药材粉末3g，加醋酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至2m l，作为阴性对照溶液；照薄层色谱法 （《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷－醋酸乙酯 （3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯 （365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图3。

2.1.4 肉豆蔻的鉴别［5］取本品5g，置250ml圆底烧瓶中，加水100ml，煎煮1h，用挥发油测定器收集挥发油（挥发油测定器中开始加入少量水及1m l醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作为供试品溶液；取肉豆蔻对照药材1g，置100ml圆底烧瓶中，加水50ml，煎煮1h，用挥发油测定器收集挥发油 （挥发油测定器中开始加入少量水及1ml醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作为对照药材溶液；另取按处方比例配制缺肉豆蔻的阴性样品5g，置250ml圆底烧瓶中，加水100ml，煎煮1h，用挥发油测定器收集挥发油 （挥发油测定器中开始加入少量水及1m l醋酸乙酯），煎煮完成后，收集醋酸乙酯部分，作为阴性对照溶液；照薄层色谱法 （《中华人民共和国药典》2010年版一部附录VIB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯－醋酸乙酯 （20∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰，见图4。

2.2 羟基红花黄色素A含量测定［6－7］

2.2.1 色谱条件 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 m）；流动相：甲醇－1%冰醋酸溶液（24∶76）；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；检测波长：403nm；进样量：10 l；理论塔板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加25%甲醇溶液制成每1ml含50μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇溶液25m l，密塞，称定重量，超声40分钟，放冷，用25%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方量以相同制剂工艺制备缺少红花的阴性对照样品，照“2.2.2”项下的供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液。

2.2.5 系统适用性考察与阴性干扰试验 照“2.2.1”项所述的液相色谱条件进行试验，精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪。试验结果：供试品色谱中，在与对照品色谱峰相应的位置上检出相应的色谱峰，且羟基红花黄色素A与相邻色谱峰的分离度均大于1.5；阴性对照溶液在与对照品溶液色谱峰相应的位置上没有相应的色谱峰，表明阴性样品对供试品的测定没有干扰。结果见图5。

2.2.6 线性关系考察 精密量取羟基红花黄色素A对照品贮备液溶液（羟基红花黄色素A含量为107.8μg/ml）1ml、3m l、5m l、8m l、10m l，分别置10ml容量瓶中，加25%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下各精密进样10μl，以峰面积（A）对对照品浓度 （C）进行线性回归，得羟基红花黄色素A回归方程：A＝6605.5C＋454.39，相关系数：R＝0.9998。结果表明，羟基红花黄色素A在10.78～107.80μg/ml范围内呈现良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 精密吸取羟基红花黄色素A对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差。结果表明，仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 按照“2.2.3”项所述方法制备供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，照“2.2.1”项所述的色谱条件记录峰面积，以后每隔2小时测定一次，考察8小时，记录峰面积并计算相对标准偏差。实验结果：供试品溶液中羟基红花黄色素A色谱峰的峰面积平均值为315447，RSD＝0.73%（n＝5），结果表明，供试品溶液中羟基红花黄色素A在8小时内测定结果稳定。

2.2.9 重复性考察 取同一批二十九味能消散样品（生产批号：20110815）4g，精密称定，共6份，按照“2.2.3”项所述方法制备供试品溶液，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，计算样品中羟基红花黄色素A的含量。实验结果：供试品中羟基红花黄色素A的含量平均值为0.3016mg/g，RSD为1.02%（n＝6）。结果表明，该分析方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取同一批二十九味能消散样品（生产批号：20110815）6份，各精密加入羟基红花黄色素A对照品，测定其含量，计算回收率。结果见表1，结果表明，该测定方法重复性较好。

表1 羟基红花黄色素A回收率实验结果

2.2.11 样品含量测定 按照“2.2.3”项所述的方法制备供试品，对三批供试品进行含量测定，结果见表2。

表2 供试品中羟基红花黄色素A含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 取羟基红花黄色素A对照品溶液，于190～500nm波长范围内进行扫描，羟基红花黄色素A在403nm波长处有最大吸收，故根据紫外吸收图谱选定403nm为检测波长。

3.2 流动相的选择 研究发现，以甲醇－1%冰醋酸溶液（20～30：70～80，V/V）为流动相时，羟基红花黄色素A均能达到很好的色谱分离效果。其中以甲醇－1%冰醋酸溶液（24：76，V/V）为流动相时效果最好，因此选用甲醇－1%冰醋酸溶液（24：76，V/V）为本试验的流动相。

3.3 供试品溶液处理方法的考察 考察了超声提取、回流提取、振揺提取3种提取方法对羟基红花黄色素A提取效果的影响，结果显示超声提取所得供试品溶液中羟基红花黄色素A含量明显高于回流提取和振揺提取，故选用提取方法为超声提取；考察了超声时间分别为30、40、50 min对羟基红花黄色素A的提取效果影响，结果显示30 min提取不完全，40min、50 min提取所得供试品溶液中羟基红花黄色素A含量无明显差异，故选择超声时间为40min。选择提取溶剂时分别考察了水、25%甲醇、甲醇三种溶剂，结果表明，水、25%甲醇与甲醇所测的羟基红花黄色素A含量基本一致，由于用水作提取溶剂过滤困难，纯甲醇毒性大，故选用25%甲醇溶液作为提取溶剂。

3.4 该研究结果表明，肉豆蔻、乳香、大黄、胡椒碱薄层色谱鉴别，分离度好，专属性强；羟基红花黄色素A的含量测定结果准确、重现性好，可有效控制本品质量。

［1］国家药品监督管理局.二十九味能消散，标准编号：WS3－BC－0140－95［S］.

［2］张健萍，刘培.活血止疼散的制备与质量控制［J］.中国药房，2005，16：13）：992－993.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：22.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：227.

［5］刘卫东，王兰英，吴维智等.扎冲十三味片的质量控制研究 ［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1647－1648.

［6］毛阿娟，王晓雯，王世祥等.HPLC法测定活血胶囊中羟基红花黄色素A、柚皮苷［J］.中成药，2011，33，（10）：1733－1736.

［7］唐颖，朱玉晓，王淑云等.HPLC法测定乐脉颗粒中丹参素、羟基红花黄色素A和芍药苷［J］.中草药，2008，39（4）：539－541.

Studies on quality standard for Ershijiuwei Nengxiao San

WEIYong－yi，SHAO Cheng－lei，MA Hong－wei
（Shandong Arura Pharmceutical Research＆Development Limited Co.，Ltd.，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Ershijiuwei Nengxiao San.METHODS：Myristicae Semen，Olibanum，Rhei radix et rhizome，Piperine were identified by TLC.The contents of Hydroxysafflor yellow A was determined by HPLC. RESULTS：The TLC spotswere clear，and the blanktest showed no interference.The linear rangeswere in the range of10.78－107.8 g（r＝0.9998）for Hydroxysafflor yellow A.Themean sample recovery rate of bergenin was98.37%，and the RSD was1.17%（n＝6）.CONCLUSION：This quality standard is accurate and reproducibly，which can be used for quality control of Ershijiuwei Nengxiao San.

Ershijiuwei Nengxiao San；Hydroxysafflor yellow A；HTC；HPLC；Quality standard

R284.1

A

1007－8517（2013）08－0012－03

2013.03.17）

魏永义 （1982年－），男，汉族，山东济南人，山东阿如拉药物研究开发有限公司，技术员，助理工程师，主要从事中药质量标准制定、新药研究开发工作。E－mail：wyy200502＠163.com。