嗅鞘细胞移植对面神经干缺损的修复研究△

顾健 朱秋蓓 朱艳玲 徐亚平 戴尉君 范静平

嗅鞘细胞移植对面神经干缺损的修复研究△

·基础研究·

顾健 朱秋蓓 朱艳玲＊徐亚平 戴尉君 范静平

目的探讨嗅鞘细胞（OECs）移植对面神经干缺损治疗的疗效。方法健康SD大鼠40只，雌雄不限，随机分为4组，每组10只。分为正常对照组、模型组、治疗组1和治疗组2。正常对照组，未予特殊处理。模型组均建立一侧（左侧）面神经颞外段总干缺损10 mm的动物模型。治疗组1和治疗组2均建成模型后用自制神经导管套接吻合神经缺损。治疗组1：在神经导管里注入等量无菌生理盐水。治疗组2：在神经导管内移植0.1mL以调整好浓度的OECs；各组分别于8周和12周检测面神经诱发电位，利用潜伏期和波幅做组间t检验。结果8周和12周后移植OECs组的面神经诱发电位的潜伏期与波幅均有所恢复，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论移植的OECs辅以神经导管对面神经干缺损的治疗有一定的效果，可以作为面神经干缺损治疗的进一步研究。（中国眼耳鼻喉科杂志，2013，13：137-140）

面神经损伤；嗅鞘细胞；神经导管；诱发电位

随着对嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的深入研究，近年来OECs在神经损伤中的应用已成为可能，并取得了相当大的成果［1-3］。本研究利用OECs促进神经损伤的修复，从而达到损伤神经功能的部分或完全恢复；并利用组织工程学原理，模仿神经组织的构造，以硅胶管作为支架替代神经外膜，用胶原蛋白海绵作为胞外基质和再生桥，局部移植OECs。以面瘫症状的评分及神经电生理作为面神经功能评价指标，观察缺损面神经干的功能改善或恢复情况，以探究OECs移植对面神经干缺损的修复效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 SD大鼠（体质量200～300 g）40只，雌雄不限，购自第二军医大学动物中心，饲养于第二军医大学神经生物实验室。DMEN/F12、胎牛血清、2.5g/L胰酶购自美国Gibco公司；山羊抗兔二氨基联苯胺显色二抗试剂盒和多克隆兔抗人p75购于美国Millipore公司，硅胶管购自济南医用硅橡胶制品厂，胶原蛋白海绵购自无锡贝迪生物工程公司。血细胞计数板、台式低速离心机、倒置相差荧光显微镜、电子刺激器、光学显微镜。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 健康SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只，每组于术后4周和8周分别进行检测。正常对照组，未手术处理与其他组同等喂养。模型组均建立一侧（左侧）面神经总干缺损10 mm的动物模型。治疗组1和治疗组2均建成模型后用自制神经导管套接吻合神经缺损。治疗组1：在神经导管里注入0.1mL无菌生理盐水。治疗组2：在神经导管内移植0.1mL已调整好浓度的OECs。

1.2.2 OECs的分离培养与纯化、鉴定 取SD大鼠6只，无菌分离嗅球，尽量剥离脑膜，剪成小组织块，用0.25％胰酶消化，然后用添加胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素、链霉素的全培养基（DMEM/F12 1∶1）中和胰酶。经吸打后接种于培养瓶中，然后按照改良的Nash差时贴壁法结合阿糖胞苷法纯化OECs。于第10天取部分OECs用多克隆兔抗人p75（1∶500）进行鉴定，使用软件定量技术计算p75 MR阳性细胞百分率，待阳性率为90％以上时，将细胞浓度调整为1×1010/L，待用（图1）。

图1A.OECs的GFAP染色（×200），箭头示绿色染色为OECs膜质 图1B.OECs的Hoechst染色（×200），箭头示蓝色染色为OECs核图1C.OECs的S-100染色（×200），红色示OECs膜质，如箭头所示

1.2.3 神经导管的制备 将硅胶管（内径2.0 mm，外径2.1mm）剪成10mm长，浸泡于75％乙醇消毒30 min，用无菌生理盐水冲洗备用。无菌条件下将胶原蛋白海绵剪成长7mm、直径2mm的圆柱体，导入硅胶管作内支架，完成神经导管的构建。

1.2.4 实验动物手术 用10％水合氯醛麻醉，在茎乳孔外分离暴露面神经颞外段总干。切去一段长6 mm的面神经上颊支，任其回缩，造成10 mm神经缺损的动物模型。2个治疗组均用自制神经导管套接吻合神经缺损，内置胶原蛋白海绵后将两神经断端各嵌入导管内2.5mm，将两端神经外膜与硅胶管壁缝合。治疗组2用微量加样器将标记好的OECs悬液0.1mL注入神经导管内，治疗组1向管腔内注入等量生理盐水，然后分层缝合伤口。所有步骤均在手术显微镜下进行。所有动物术后3 d均给以30万U青霉素肌内注射，1次/d，于第二军医大学神经生物实验室分笼饲养，标准食水饲养至术后8周和12周。

1.3 观察指标

1.3.1 面部及大体观察 分别于术后8周和12周观察切口外表有无异常红肿及炎性分泌物，并根据大鼠的瞬目反射、触须运动和鼻尖位置进行评分。根据不同组别的评分结果进行比较。

1）瞬目反射。用5 mL注射器装18G针头，距大鼠眼睛2 cm处，瞬间向眼内吹入空气，观察大鼠眼睑活动及闭合情况：①2分为双侧无明显差异；②1分为患侧较对侧闭合延迟；③0分为患侧眼睑不能闭合。

2）触须活动。计数30s内双侧触须：①2分为双侧触须活动无明显差异；②1分为患侧触须活动较对侧减弱；③0分为患侧触须活动消失。

3）大鼠鼻尖位置：①2分为鼻尖居中；②1分为鼻尖偏向对侧。

1.3.2 神经电生理检测 应用电子刺激器（SEN-3201，光电公司，日本）在面神经远端刺激神经，给予幅值为20 mV、时程为100～200 ms、频率为1 Hz的刺激脉冲。在中枢端（靠近面神经出茎突孔处）用银丝电极记录面神经的动作电位，信号经前置放大器放大（5 000倍，滤波1 K，时间常数0.25）后，用平均叠加仪叠加（叠加64次）信号显示在示波器，然后记录并计算动作电位的幅值及时程。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，实验结果采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。检验水准a=0.05。

2 结果

2.1 大体观察 术后4周和8周，40只实验鼠均正常存活。切口外表无异常红肿及炎性分泌物。面神经功能见表1。

表1 各组不同时间段评分值（分）

2.2 神经电生理学测定（图2、表2）

从表2可以看出8周和12周后，治疗组2与同期模型组比较，在导管及支架材料条件下局部注入的OECs使面神经诱发电位的潜伏期明显缩短（P＜0.01），并使面神经诱发电位的幅值明显升高（P＜0.01），结果都具有统计学意义。治疗组2与治疗组1比较（P＜0.05）、治疗组1与同期模型组比较（P＜0.05），结果都具有统计学意义。

另外可以看出，8周和12周后，治疗组2面神经诱发电位的潜伏期与波幅均有所恢复，但与同期正常对照组比较仍未完全恢复。

图2A.12周正常对照组诱发电位图；图2B.12周正常对照组诱发电位图；图2C.12周正常对照组诱发电位图；图2D.12周正常对照组诱发电位图。白色箭头示面神经诱发电位潜伏期，黑色箭头示诱发电位波幅

表2 术后8周和12周诱发电位潜伏期和波幅值比较（n=10）

3 讨论

面神经损伤在耳面部外伤中较为常见，针对不同的损伤类型，临床上常采取保守药物治疗或外科手术。后者如自体神经移植治疗，但自体神经来源有限、取材后易造成继发感染和畸形，因而限制了它在临床的应用。而OECs相对易于获取且来源丰富，使之在神经损伤修复中的应用已成为研究重点，并取得了相当大的成果。有研究［1-3］通过实验证明，OECs对于脊髓损伤、脑卒中和周围神经损伤、帕金森病等都有一定的疗效。Guntinas-Lichius等［4］研究发现，在大鼠面神经横断后于损伤处移植嗅黏膜组织可明显促进损伤面神经的再生和功能恢复。关于OECs移植后可能的作用机制尚不明确，主要包括以下几个方面：①移植后的OECs下调了反应性星形细胞胶质纤维酸性蛋白和蛋白多糖的表达，降低了这些物质的反应，从而为轴索的再生提供了良好的保护环境［5-6］；②OECs有一定的迁徙能力，能伴随再生轴索跨越胶质瘢痕形成的抑制环境，促进部分下降通路的发芽、再生［7-8］；③OECs表达和分泌的多种黏附分子及神经营养因子帮助神经元存活并促进轴索生长，同时对再生轴索提供趋化导引作用［9-10］；④防止残留神经纤维的激发性脱髓鞘，帮助再生轴索髓鞘再生，保证传导的完整性［11-13］。另外OECs是一种移植免疫缺陷细胞，这也有助于其作为神经损伤移植或修复的良好候选种子细胞。

本实验主要通过面瘫症状评分、面神经诱发电位的潜伏期和波幅对OECs移植的疗效进行判定。实验结果显示，OECs组的治疗效果与其他组比较有明显差异。这证实了OECs具有改善损伤周围神经修复的功能。

本实验还对治疗组1和模型组的治疗结果进行比较，证实神经导管对面神经功能的改善与恢复也具有很大影响。神经导管内部支架的构建对神经再生有重要影响。适宜的内部支架可以增加导管内表面的粗糙程度，使细胞与导管间的相互作用增加，从而克服了导管对细胞亲和力较差的缺点，支持细胞的贴附、分化和轴突再生神经导管具有特定的三维结构，可接纳再生的轴突长入，规定了再生轴突的方向性［14-15］。Lundborg等［16］用硅胶管制成外支架，管内用八聚酰胺丝作为内支架，成功引导大鼠再生轴突通过15 mm的神经缺损。Nakamura等［17］将胶原海绵填充于聚乳酸导管内制成人工支架，桥接狗15 mm腓神经缺损，收效良好。据此，我们采用硅胶管和胶原蛋白海绵。硅胶管具有组织相容性好、无生物毒性、物理性能稳定、不会塌陷的优点。胶原蛋白是细胞外基质的组成部分，是细胞赖以生存和维持细胞功能的生物学基础［18-19］。利用特殊工艺制成的胶原蛋白海绵具有更高的面积/体积比，能为移植细胞提供更大的黏附表面，携带更多的移植细胞［20-21］。

总之本实验表明，在面神经干断裂的情况下，以OECs作为种子细胞，以硅胶管为支架，以胶原蛋白海绵为内在填充物代替细胞外基质，最终改善或恢复损伤面神经的功能效果理想。但本实验对细胞分子层面进行面神经功能改善的具体机制尚未阐明，故需进一步研究。

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Primary study of olfactory ensheathing cell transplantation in facial nerve defect ratmodel GU Jian，ZHU Qiu-

pei，ZHU Yan-ling＊，XU Ya-ping，DAIWei-jun，FAN Jing-ping.Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

FAN Jing-ping，Email：fanjingp＠163.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of olfactory ensheathing cell transplantation in facial nerve defect ratmodel.M ethods Forty SD rats were randomly divided into four groups of 10 in each：Control group（CG），Model group（MG），Treatment group1（TG1）and Treatment group 2（TG2）.In CG，the rats were untreated.In MG，the temporal segments of facial nerveswere cut off to form 10mm defects on the left side of the rats.In TG1 and TG2，neural tubes weremade to joint the nerve defects.TG1：inject sterile saline in the neural tube.TG2：transplant 0.1mLOECs in the neural tube.The facial nerve evoked potentials were detected in 8 and 12 weeks after the injection respectively.The t testwas used to analyze the latency and amplitude of the evoked potentials.Results The latency and amplitude of the facial nerve evoked potentials were all increased in 8 and 12 weeks after OECs transplantation in the model group（P＜0.01）.The results were statistically significant.Conclusions Olfactory ensheathing cells transplantation was effective in the ratmodel of neural tube defects，and it could be served as a potential treatment in facial nerve defect for further research.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：137-140）

Facial nerve injury；Olfactory ensheathing cells；Neural tube；Evoked potentials

2012-10-09）

（本文编辑 杨美琴）

中国人民解放军军队“十二五”重点项目（BWS11C035）

第二军医大学附属长征医院耳鼻喉-头颈外科 上海 200003；＊第二军医大学神经科学研究所 上海 200433

范静平（Email：fanjingp＠163.com）