束缚应激模型大鼠体重及生化指标含量变化

许 鹏，迟 强，卢 山，郭春梅，徐珺洋

(1.中国人民解放军第215 医院，辽宁 大连116041;2. 大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连116044)

应激是机体受到各种内外环境因素及社会、心理因素刺激引起的一系列全身性非特异综合性应答反应，表现为下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)系统及交感神经-肾上腺髓质系统的兴奋，并伴有众多组织和器官的功能变化［1］。应激动物模型的建立是研究应激的基础，慢性束缚应激动物模型已被证明是一种能引起典型非特异应激表现的有效方法，其可以通过剥夺动物活动自由而产生纯粹的挫折应激，这种应激造成模型动物心理紧张状态，倾向于通过非特异性的心理和生理反应表现出来，应激时众多神经内分泌功能发生变化，从而造成免疫功能低下，而且束缚应激能抑制动物体重增加［2-3］。束缚应激与人类心身性疾病过程相似，同时又适应应激领域由急性转入慢性的发展趋势，被广泛用于抑郁症的相关研究。

本实验模拟慢性束缚应激过程，观察大鼠慢性束缚应激不同时间体重及血清中皮质酮(CORT)，去甲肾上腺素(NE)，热休克蛋白70 (HSP70)、白介素2 (IL-2)和白介素4 (IL-4)的变化，探讨慢性束缚应激不同时间对动物体重、免疫功能及神经递质的影响，为心理应激功能研究提供实验依据和理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验对象与试剂

雄性清洁级Wistar 大鼠30 只，6 周龄，体重(90 ±3)g 购于大连医科大学SPF 动物实验中心［合格证编号:SYXK(辽)2008 - 0002］;CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL -4 酶联免疫检测试剂盒购于Abcam 公司;其他试剂均为国产分析纯;酶标仪为Thermol 公司产品;固定器为北京智鼠多宝生物科技有限公司产品。

1.2 动物分组

大鼠适应环境7 d 后随机分为3 组:正常对照组(C)、束缚3 周组(R3)和束缚5 周组(R5)，每笼5 只，饲养于清洁级动物房。室内温度保持为(22 ±2)℃，相对湿度保持为30% ～40%，各组大鼠常规饲料，自由进食饮水，并每日触摸动物以适应实验人员的操作。

1.3 处理方法

除正常对照组外，每天早9:00 将大鼠置于不能自由活动的固定器内，连续束缚6 h，1 次/d，连续束缚3 周或5 周。束缚时3 组大鼠均禁食禁水，应激大鼠不受挤压无损伤，不影响呼吸和排泄，但运动受限。首先对R5 组大鼠进行束缚，2 周后对R3 组大鼠进行束缚。

1.4 体重称量

大鼠称重均在早上进行，所有大鼠在束缚前1天和束缚结束后第2 天均进行1 次体重测量。

1.5 生化指标测定

各组大鼠在束缚应激结束后第2 天，眼球静脉采血2 mL，室温静置2 h，待血液凝固后于4℃3000 r/min 离心20 min，分离血清，并置于-80 ℃保存待测。采用ELISA 法检测CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL-4 的含量，测定时所有样品用生理盐水稀释10倍，具体操作过程严格按试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

SPSS11.5 统计软件对实验数据进行统计分析，结果用均数±标准差(± s)表示，差异检验用方差分析和t 检验，P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 行为变化

随着束缚时间的延长，大鼠发生明显的行为变化，与C 组比较，束缚组大鼠进食量减少、行为迟缓、长期站立不动、尖叫、不断的淌泪、皮毛和面部不洁、毛须竖立、目光呆滞。

2.2 体重变化

慢性束缚应激显著抑制大鼠体重增加，与C 组相比，R3 组和R5 组大鼠分别显著降低了29.94%和33.23%(P ＜0.05)，且随着束缚时间延长，大鼠体重抑制越明显，R5 组大鼠比R3 组降低了14.57%(P ＜0.05)，见表1。

表1 慢性束缚应激对大鼠体重的影响Tab 1 The effect of chronic restraint stress on body weight

2.3 生化指标变化

慢性束缚应激可使大鼠血清CORT 含量升高，与C 组相比，R3 组和R5 组分别升高了11.25%和46.65%(P ＜0.05)，且具有时间依赖性，随着束缚时间延长，含量升高越明显，R5 组含量比R3 组升高了31.82%(P ＜0.05)。

慢性束缚应激后，R3 组和R5 组NE 含量比C组分别显著升高了25.16% 和39.09%(P ＜0.05)，且具有时间依赖性，随着束缚时间延长，升高越明显，R5 组比R3 组升高了11.13%(P ＜0.05)。

R3 组和R5 组与C 组相比HSP70 含量分别升高了5.15%(P ＞0.05)和13.49%(P ＜0.05)，R5组含量比R3 组升高了7.93%(P ＜0.05)。

与C 组相比，慢性束缚应激后 R3 组和R5 组IL-2含量分别降低了15.43%和16.01(P ＜0.05)，但不具有时间依赖性，随着束缚时间延长，其含量并没有明显降低。

慢性束缚应激后大鼠血清中IL -4 含量升高，R3 组和R5 组分别升高了9.86%和18.69%(P ＜0.05)，且具有时间依赖性，R5 组比R3 组升高了8.04%(P ＜0.05)。见表2。

表2 慢性束缚应激对大鼠CORT、NE、HSP70、IL-2 和IL-4 含量的影响Tab 2 The effect of chronic restraint stress on the content of CORT，NE，HSP70，IL-2 and IL-4

3 讨 论

应激抑制大鼠体重增长的原因可能归结于皮质酮(COPT)升高，皮质酮可以增加机体对胰岛素的敏感性、减少食物的摄入量而导致体重减轻，而且皮质酮还可促进蛋白质分解，抑制其合成，同时也影响糖类和脂类的代谢，这些最终导致体重增长缓慢［4］。本研究在束缚过程中发现束缚组大鼠进食量减少，根据行为变化和体重变化初步确定造模成功。

本研究中，束缚应激导致了大鼠血清CORT 升高，且束缚时间越长，对大鼠损害越明显。因为应激主要激活HPA 轴，老鼠受到束缚后，由于激怒，使得交感神经兴奋，下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放因子(CRH)经垂体门脉系统进入垂体前叶，促使促肾上腺皮质激素(ACTH)产生，此激素作用于肾上腺皮质，使之分泌大量的糖皮质激素(GC，皮质醇和皮质酮)，最终发挥生物学作用，而GC 的分泌反过来又抑制ACTH 和CRH 的释放，形成负反馈机制，而且GC 水平升高，导致海马神经元内糖皮质激素受体(GR)受损，密度下降，进而HPA 轴脱抑制［5-8］。

NE 是由肾上腺髓质分泌的一种儿茶酚胺激素，属于一种单胺类神经递质。单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要物质，许多实验证明，单胺类神经递质在应激状态下有所改变，还有研究表明大鼠抑郁样行为可能与NE 含量升高对色氨酸代谢影响有关［9］。CORT 和NE 是研究的比较多的指标，本研究结果与前期报道一致。

目前普遍认为外周血清HSP70 能体现机体的应激程度，慢性束缚引起大鼠血清HSP70 浓度显著升高，提示慢性束缚对机体是损伤性因素［10］。热休克蛋白HSP70 是一种进化上高度保守的应激蛋白，细胞内HSP70 主要参与细胞内蛋白质的折叠、装配、降解和修复过程，调节蛋白活性，介导蛋白转运和维护蛋白的自稳系统等。正常情况下大多数组织细胞内其含量很低，当机体遭受各种生理、病理或心理应激时表达会明显增加［11］。运动应激能够诱导机体HSP70 生成，HSP70 的适度增加可增强机体的适应能力，从而成为一种保护机制，HSP70 具有抗氧化的生物活性，对应激有较强的抵抗作用［12-13］。本研究中，小鼠束缚5 周后，HSP70 明显升高。

IL-2 主要由活化的T 淋巴细胞产生，能维持T淋巴细胞在体外的生长，并激活多种免疫细胞，还可以活化NK 细胞、B 淋巴细胞，分泌抗体，是调节机体免疫功能最主要的细胞因子之一，其水平反映了T 细胞的功能状态［14-15］。本研究中，慢性束缚降低了大鼠血清IL-2 含量，说明束缚应激使大鼠的免疫功能受到抑制，与前期报道一致［14-16］。

IL-4 具有调节免疫应答、急性期反应、并参与机体炎症反应的抗感染防御作用，同时具有激活HPA 轴的作用，而且许多研究报道，束缚应激能使HPA 轴功能亢进［17］。但关于束缚应激与IL-4关系的研究鲜有报道。本研究中，慢性束缚后，大鼠血清IL-4 含量升高。

本实验结果表明:慢性束缚应激可抑制大鼠体重增长，改变血清中CORT、NE、HSP70、IL -2 和IL-4的含量，可成为重要的分子靶标，为各种相关心身性疾病的防御和治疗提供分子生物学基础和实验依据。

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