Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表达及意义

孙忠杰，刘志宇，王乃玉

(1.解放军第404医院泌尿外科，山东 威海 264200;2.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁 大连 116027;3.大连医科大学附属第二医院 病理科，辽宁大连 116027)

Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表达及意义

孙忠杰1，刘志宇2，王乃玉3

(1.解放军第404医院泌尿外科，山东 威海 264200;2.大连医科大学附属第二医院泌尿外科，辽宁 大连 116027;3.大连医科大学附属第二医院 病理科，辽宁大连 116027)

目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路成员Sonic-hedgehog(Shh)和微管不稳定蛋白Stathmin在前列腺增生症和前列腺癌中的表达情况及临床意义。方法 应用免疫组织化学方法分别检测30例前列腺增生症和30例前列腺癌中Shh和Stathmin蛋白的表达情况，并分析其与临床相关参数之间的关系。结果 在前列腺癌组织与前列腺增生症组织Shh阳性表达率分别为73.33%(22/30)与36.67%(11/30)(P＜0.01)，Stathmin阳性表达率分别为83.33%(25/30)与23.33%(7/30)，(P＜0.01)。前列腺癌中 Shh 与 Stathmin 的表达呈正相关(r=0.522，P＜0.01)。前列腺癌组织Shh和Stathmin蛋白的表达与患者PSA水平、前列腺重量间无显著相关关系(P＞0.05)，但在肿瘤不同临床分期(TNM)、病理分级(Gleason分级)间差异显著(P＜0.05)。结论 Shh和Stathmin在前列腺癌的演进中起一定的重要作用。

Shh;Stathmin;前列腺癌;免疫组织化学

前列腺癌(prostatic cancer，PCA)是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其发病率有明显的地理和种族差异，欧美地区较高，亚洲发病率较低，世界范围内，前列腺癌的发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二［1］。目前，前列腺癌的治疗仍以手术治疗、内分泌治疗和放疗等为最主要的手段，对于早期前列腺癌患者治疗效果尚可，但对于中晚期患者疗效不甚理想。随着分子生物学理论和技术的发展，靶向诊断治疗越来越引起人们的关注。多种与前列腺疾病发生进展相关的靶向分子和蛋白被相继发现，如Sonic-hedgehog(Shh)和Stathmin，这可能为前列腺癌的诊断治疗提供新的靶点、新的手段。本文旨在探讨Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表达情况及临床意义。

1 材料和方法

1.1 标本来源及临床资料

前列腺癌标本来自大连医科大学附属第二医院2008—2011年住院手术患者，共30例，年龄58～90岁，平均83.2岁，经腹或直肠B超测算前列腺重量20.18 ～102.79 g，平均 52.40 g。患者入院查 PSA水平 2.61 ～100 ng/mL，平均55.41 ng/mL。临床分期按TNM进行分期:T1期10例，T2期9例，T3期4例，T4期7例。病理分级(Gleason分级)为:高分化4例，中分化9例，低分化17例。前列腺增生症标本来自大连医科大学附属第二医院2010—2011年前列腺增生症住院手术患者，共30例。所有标本均经10%福尔马林溶液固定常规石蜡包埋保存，所有病例术前均未经放化疗，均经手术及病理确诊且有完整临床资料。

1.2 试 剂

所用I抗均为即用型工作液，分别为:兔抗人Shh抗体(美国chemicon公司)、兔抗人Stathmin抗体(购自武汉三鹰生物技术有限公司)。浓缩型DAB试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、DAB底物显色剂均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3 方 法

采用免疫组织化学法对30例前列腺增生症和30例前列腺癌组织标本分别进行Shh和Stathmin检测。免疫组化步骤按照试剂盒要求进行。

1.4 结果判定

Shh和Stathmin以胞浆中或胞膜上出现棕黄色颗粒判断为阳性细胞，以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分作定性分析。选取染色密集区，随机地观察5个中倍视野(×200)，算出各个视野中阳性细胞数的平均百分比数作为该切片的阳性细胞百分比进行计分:＜25%弱阳性计为1分，26% ～50%中等阳性计为2分，＞51%计为3分。染色强度则以阳性细胞呈现的染色特征为标准进行计分:细胞无染色计为0分，染色呈淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分，然后根据两者相加所得的总分进行结果判定。0～3分为阴性(-)，4～5分为弱阳性(+)，6～7分为中度阳性(++)，8～9分为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0软件包进行统计学分析，分类变量以百分数或直接计数表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法进行统计分析，两变量间的关联分析采用Spearman秩相关或偏相关分析。P＜0.05表示差异具有显著性意义，P＜0.01表示差异具有非常显著性意义。

2 结 果

2.1 Shh和Stathmin在前列腺增生症与前列腺癌组织中表达情况

Shh在前列腺癌与前列腺增生症组织中的阳性表达率分别为 73.33%(22/30)与 36.67%(11/30)，Stathmin在前列腺癌与前列腺增生症组织中的阳性表达率分别为83.33%(25/30)与23.33%(7/30)，其棕黄色颗粒主要表达于胞浆中或胞膜。见图1、2。前列腺癌组织的Shh和Stathmin的阳性表达率均明显高于前列腺增生症组织，差异具有非常显著性意义(P ＜0.01)。

图1 前列腺癌中Shh蛋白阳性表达(SP×200)Fig 1 The positive expression of Shh protein in prostatic carcinoma tissues(SP×200)

图2 前列腺癌中Stathmin的阳性表达(SP×200)Fig 2 The positive expression of Stathmin protein in prostatic carcinoma tissues(SP×200)

2.2 Shh和Stathmin蛋白的表达结果与前列腺癌患者临床相关参数的关系

前列腺癌组织中Shh和Stathmin蛋白的表达在患者不同PSA、术前B超前列腺重量间比较差异无显著性意义(P＞0.05)，但在不同临床分期、病理分级间比较差异却有显著性意义(P＜0.05)。见表1。

表1 Shh和Stathmin蛋白的表达与前列腺癌患者临床相关参数的关系Tab 1 The relationship between the expression and related clinic and pathological features (n)

2.3 前列腺癌中Shh蛋白和Stathmin蛋白免疫组化结果相关性分析

前列腺癌中Shh蛋白和Stathmin蛋白的表达呈正相关(r=0.522，P=0.005 ＜0.01)，见表2。

表2 Shh和Stathmin之间的相关性Tab 2 The relationship between Shh and Stathmin (n)

3 讨 论

Hedgehog信号通路是一个近来研究十分热门的通路，其成员Shh与其他信号通路(如Stathmin、Notch、EGF等)相互作用、相互影响，共同参与促进前列腺胚胎发育、前列腺癌的疾病进展。Stathmin蛋白在肿瘤发生发展中也起十分重要的作用，但对于其在前列腺癌疾病进展中的研究尚少。

3.1 Shh与前列腺癌

Hedgehog信号通路由 Hedgehog(Hh)配体(Shh、Ihh、Dhh)、2 个跨膜受体复合物:Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)、下游转录因子Gli家族(Gli1、Gli2、Gli3)等组成。Shh对哺乳动物的毛发、前列腺、乳腺、肺和神经系统等多器官的发育起重要作用［2］。Shh的表达为前列腺发育的起始所必需，采用抗RT-PCR的方法检测Dhh和Ihh在前列腺发育过程中表达，没有发现Dhh的表达，而Ihh的表达量极低［3］。采用抗Shh抗体或者Hh通路阻断剂作用于小鼠泌尿生殖窦，可导致前列腺的导管形成障碍［4］。Fan 等［5］报道 Shh 表达在前列腺上皮，Gli1则表达在前列腺基质，并认为Shh过度表达将增加基质上的Gli1表达，从而刺激癌细胞的生长。

Karhadkar等［6］研究发现癌旁正常组织、局限性前列腺癌、转移性前列腺癌均表达Shh和Ihh，但正常前列腺组织不表达 Ptch和 Gli。Sanchez等［7］对前列腺癌和良性前列腺增生症进行检测，与＜1%的正常组织Shh表达相比，其中33%的肿瘤标本Shh高度表达(P＜0.05)，同时其用 RT-PCR对前列腺癌细胞系检测，发现其Shh、Ptch1、Gli1、Gli2和Gli3均高度表达。本实验中，Shh蛋白在前列腺增生症中不表达或低表达，而在前列腺癌中有高表达，差异具有非常显著性意义(P＜0.01)。因此，认为Shh存在于前列腺癌疾病发生、发展的过程中，并可能对前列腺癌的进展起重要作用。

本研究还分析了Shh蛋白的表达情况同前列腺癌患者的临床参数(PSA、术前前列腺重量、临床分期、病理分级)的关系。结果表明，前列腺癌组织中Shh蛋白的表达在患者不同PSA、术前B超前列腺重量间比较差异无显著性意义(P＞0.05)，但在不同临床分期、病理分级间比较差异有显著性意义(P＜0.05)，临床分期越晚、病理分化程度越低，则Shh表达水平就越高。但这一结果与Sanchez等［7］的研究相反，其研究发现Shh与Gleason评分或临床分期之间均没有关联性，考虑是由于本研究方法不同及标本数量有限等原因造成的，这一结果有待进一步证实。

3.2 Stathmin与前列腺癌

Stathmin蛋白是一种微管不稳定蛋白［8］，在大量的组织和物种中广泛存在，表达于细胞质内。

Stathmim作为肿瘤标志物，现已证实在多种恶性肿瘤(如白血病、淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、宫颈癌等)中都有高水平表达。有研究发现Stathmin表达最早出现在前列腺胚胎发育早期，随后在前列腺增生症、PIN、前列腺癌进展过程中Stathmin的表达量逐渐增多［9］。Mistry等［10］将腺病毒介导的抗 Stathmin核酶转染前列腺癌细胞系，结果抑制了癌细胞系恶性表型的表达，使癌细胞分裂停止在G2/M期，大部分细胞进入程序性凋亡。Mistry等［11］又将腺病毒介导的抗Stathmin核酶注入人前列腺癌细胞的裸鼠成瘤模型中发现30%肿瘤生长明显抑制，70%肿瘤生长几乎完全停止。以上都说明Stathmin与前列腺癌密切相关。本研究发现Stathmin蛋白在前列腺增生症组织中不表达或低表达，在前列腺癌中有高表达，差异具有非常显著性意义(P＜0.01)。因此，同样认为Stathmin存在于前列腺癌疾病发生、发展的过程，可能对前列腺癌的进展起重要作用。

Friedrich［12］研究发现Stathmin表达水平与前列腺癌的细胞分化程度、组织学分级有关，本实验同样验证这一结论。本实验结果表明前列腺癌组织中Stathmin的表达程度在患者不同PSA、术前B超所测前列腺重量间比较差异无显著性意义 (P＞0.05)，但在不同临床分期、病理分级间比较差异却有显著性意义(P＜0.05)，临床分期越晚、病理分化程度越低，则Stathmin表达水平越高。

3.3 Shh和Stathmin的相关性

目前对于Shh和Stathmin二者之间的关系研究甚少，Chung MK 等［13］研究了前列腺癌细胞 AT2.1株系和DU-145株系以及8例前列腺癌患者的手术标本，发现Stathmin的表达可能受Hedgehog信号通路蛋白的调节。本实验发现Shh和Stathmin从前列腺增生症到前列腺癌过程中表达依次增多，统计分析显示前列腺癌中Shh与Stathmin的表达呈正相关。因此，可以看出Shh蛋白和Stathmin蛋白在前列腺癌病变过程中表达模式相似，在肿瘤的侵袭转移中可能发挥着类似的功能，推测二者之间可能存在某些联系，其相互作用可能对前列腺癌的进展起重要作用。但由于本实验标本较少，结论的可靠性有待进一步研究证明。

:

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.A Cancer Journal for Clinicians，2011，2(61):69 -90.

［2］Kayed H，Kleeff J，Kejeg S，et al.Distribution of Indian hedgehog and its receptors patched and smoothened in human chronic pancreatitis［J］.J Endocrinol，2003，178(3):467-478.

［3］Podlasek CA，Barnett DH，Clemens JQ，et al.Prostate development requires Sonic hedgehog expressed by the urogenital sinus epithelium［J］.Dev Biol，1999，209(1):28 -29.

［4］Lamm ML，Catbagan WS，Laciak RJ，et al.Sonic hedgehog activates mesenchymal Gli1 expression during prostate ductal bud formation［J］.Dev Biol，2002，249(2):349 -366.

［5］Fan L，Dibble CC，Laciak R，et al.Hedgehog signaling promotes prostate xenograft tumor growth［J］.Endocrinology，2004，145(8):3961 -3970.

［6］Karhadkar SS，Bova GS，Abdallah N，et al.Hedgehog signaling in prostate regeneration，neoplasia and metastasis［J］.Nature，2004，431:707 -712.

［7］Sanchez P，Hernandez AM，Stecca B，et al.Inhibition of prostate cancer proliferation by interference with Sonic hedgehog- Gli-1 signaling［J］.Pros Natl Acad Sci USA，2004，101(34):12561 -12566.

［8］Cassimeris L.The oncoprotein 18/Stathmin family of microtubule destabilizers［J］.Curr Opin Cell Biol，2002，1(14):18-24.

［9］Ferrari AC，Seuanez HN，Hanash SM，et al.A gene that encodes for a Leukemia-associated phosphoprotein(p18)maps to chromosome bands 1p35 - 36.1［J］.Genes Chromosomes Cancer，1990，2(2):125 -129.

［10］Mistry SJ，Bank A，Atweh GF.Targeting Stathmin in prostate cancer［J］.Mol Cancer Ther，2005，4(12):1821 -1829.

［11］Mistry SJ，George F.Microtubule targeting therapy:Anti-Stathmin based molecular cancer therapeutics in vivo［J］.J Proc Amer Assoc Cancer Res，2006，47(2):664 -669.

［12］Friedrich B，Gronberg H，Landstrom M，et al.Differentiation-stage specific expression of oncoprotein 18 in human and rat prostatic adenocarcinoma［J］.Prostate，1995，27(2):102-109.

［13］Chung MK，Kim HJ，Lee YS，et al.Hedgehog signaling regulates proliferation of prostate cancer cells via Stathmin1［J］.Clin Exp Med，2010，1(10):51 -57.

Expressions of Shh and Stathmin in prostatic diseases and their clinical significances

SUN Zhong - jie1，LIU Zhi- yu2，WANG Nai- yu3
(1.The No.404Hospital of PLA，Weihai264200，China;2.Department of Urology;3.Department of Pathology，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

［Abstract］ObjectiveTo investigate the clinical significance of Sonic-Hedgehog(Shh)and Stathmin expressions in human benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma.MethodsThe expression of Shh protein and Stathmin protein are detected in 30 cases of human benign prostatic hyperplasia tissues，and 30 cases of prostatic carcinoma tissues with immunohistochemistry method.ResultsIn human prostatic carcinoma and benign prostatic hyperplasia，the positive expression rates of Shh protein were 73.33%(22/30)and 36.67%(11/30)respectively detected，the rates of Stathmin were 83.33%(25/30)and 23.33%(7/30)respectively.There was a significant differences of both protein expressions between the two groups(P＜0.05)，the rates of Shh has a positive correlation with Stathmin(r=0.522，P＜0.01).The expression of Shh or Stathmin had no correlation with the PSA level and prostate weight(P＞0.05)，but there is a singnificant difference in patients with different clinical stage and gleason score(P＜0.05).ConclusionThe expressions Stathmin and Shh may play a important role in prostatic disease progression.

［Key words］Shh;Stathmin;prostatic carcinoma;immunohistochemical

R392-33

A

1671-7295(2013)01-0034-04

孙忠杰，刘志宇，王乃玉.Shh和Stathmin在前列腺疾病中的表达及意义［J］.大连医科大学学报，2013，35(1):34 -37.

10.11724/jdmu.2013.01.08

孙忠杰(1984-)，男，山东乳山人，医师。E-mail:sunzhongjie521@163.com

刘志宇，教授，博士。E-mail:letter89@163.com

2012-07-05;

2012-11-30)