静态注射化学发光法测定黄芩苷含量

张亚莉，李景印，哈婧，李玉佩，王未肖

（1.河北科技大学 理学院，河北 石家庄 050018；2.河北科技大学 化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018）

黄芩苷（baicalin，C21H18O11）属于多酚羟基的黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分和质量控制指标.具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等生物活性［1－4］，还能对早期肾功能损伤和急性肝损伤起到保护作用［5－6］，以及吸收紫外线、清除氧自由基、抑制黑色素的生成等作用.因此对黄芩苷测定方法的研究具有重要的意义.目前常用的黄芩苷测定方法有高效液相色谱法及色质联用［7－10］、毛细管电泳［11］、光谱法［12－13］、薄层色谱法［14］及X线衍射分析方法［15］，但这些方法的检出限都较低.化学发光分析技术法由于其仪器装置简单、灵敏度高、操作快速等特点已被广泛应用在环境、食品、药物及免疫分析等许多分析科学领域［16］.本实验采用静态注射化学发光法，利用黄芩苷对碱性条件下鲁米诺和双氧水化学发光体系的抑制作用，建立了中草药黄芩中黄芩苷含量的检测方法，并将测定结果与高效液相色谱法测定结果进行对比，结果一致.

1 实验部分

1.1 主要原料

鲁米诺（SigmaA8511）：北京拜尔迪生物公司；黄芩苷标准品：中国食品药品检定院；体积分数30%过氧化氢（H2O2）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市百世化工有限公司；氢氧化钠（分析纯）：北京精细化学品有限责任公司.鲁米诺溶于0.1mol／L NaOH配制成2×10－2mol／L储备液，置于冰箱冷藏，实验时用0.1mol／L NaOH溶液稀释至合适浓度.黄芩苷溶于体积分数60%乙醇配制成1×10－3mol／L储备液，置于冰箱冷藏，实验时用二次蒸馏水稀释至合适浓度.实验用水均为二次蒸馏水.

1.2 主要设备

BPCL型化学发光仪（中国科学院生物物理研究所）；高效液相色谱仪（AgilentTechnologies 1200Series）：安捷伦科技有限公司；电子天平（AL204）：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；石英自动双重纯水蒸馏器：江苏省金坛市富华有限公司；微型植物试样粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司.

1.3 实验步骤

在1.5mL塑料离心管中将黄芩苷标准品储备液（或待测样品，空白实验用体积分数60%乙醇，实验表明乙醇对化学发光信号也有一定的抑制作用）用二次蒸馏水稀释至合适浓度，用可调微量进样器吸取50μL试液和40μL鲁米诺的碱性（氢氧化钠浓度为0.016mol／L）溶液加入发光池，置于发光仪测量室中，打开光门，用进样器向发光池中加入40μL的H2O2溶液，用化学发光仪测定发光强度，发光池每次用完用蒸馏水冲洗2遍以减少随机误差.化学发光仪负高压为500V.

2 结果与讨论

2.1 化学发光条件的选择

2.1.1 化学发光反应的动力学性质

图1中给出了室温下该实验的化学发光反应动力学曲线.其中曲线1表示luminol－H2O2－NaOH体系的化学发光曲线，曲线2表示加入黄芩苷后luminol－H2O2－NaOH体系的化学发光曲线.由图可见：1）由进样器注入H2O2溶液后4s发光强度达到最大值，随后迅速降低，说明该化学发光体系是快发光反应.2）黄芩苷对该发光体系有明显的抑制作用.

2.1.2 Luminol浓度的影响

实验了鲁米诺不同浓度下的化学发光强度（luminol－H2O2，luminol－H2O2－乙醇，luminol－H2O2－黄芩苷）.结果如图2所示，以样品抑制发光强度与空白抑制发光强度的比（以下同）对luminol的浓度进行作图，在浓度1×10－5～8×10－4mol／L，比值随着鲁米诺浓度的增加而增加，在鲁米诺浓度为5×10－5mol／L时达到最大，此后相对发光强度的比值逐渐减小，因此本实验选择的鲁米诺浓度为5×10－5mol／L.

2.1.3 氢氧化钠浓度的影响（碱性条件）

鲁米诺的氧化发光反应需在碱性介质中进行，碱性条件对luminol－H2O2化学发光强度有显著的影响.实验发现随着NaOH浓度的增加，样品和空白的相对发光强度明显增强，相对发光强度比值在NaOH浓度为0.016mol／L达到最大而后逐渐降低（图3），因此本实验选择的 NaOH 浓度为0.016mol／L（pH＝12.2）.

2.1.4 H2O2浓度的影响

实验了不同浓度的H2O2对相对发光强度的影响.结果如图4所示，在0.01～0.06mol／L内，相对发光强度在H2O2浓度为0.03mol／L时达到最大而后减小，因此本实验选择的H2O2浓度为0.03mol／L.

2.2 线性范围、精密度和检出限

在选定的最佳实验条件下对黄芩苷进行测定，黄芩苷浓度在1×10－8～3×10－7mol／L内呈良好的线性关系，线性方程为ΔI＝41.03c＋74.66（其中，ΔI为体系抑制的发光强度，c为黄芩苷的浓度（10－7mol／L）），线性相关系数为0.996 3.检出限为2.93×10－9mol／L（以最小检测浓度5.0×10－9mol／L计算，11次空白的相对标准偏差是2.5%）；对浓度为3×10－8mol／L的黄芩苷平行测定11次，计算其相对标准偏差（RSD）为2.3%，满足分析测定要求.

2.3 干扰测定

在选定的最佳实验条件下，以2×10－7mol／L的黄芩苷进行干扰测定，考察了几种离子对黄芩苷测定的影响.结果表明，当相对误差≤ ±5% 时允许共存的物质有PO3－4，可溶性淀粉、葡萄糖（1 000倍）；20倍的Fe3＋基本没有干扰，但随着Fe3＋浓度的增大其对体系会有增强作用，影响黄芩苷含量的测定；Cu2＋对本体系发光强度具有明显的增强作用.

2.4 样品的提取与检测及回收率测定

将购买的4份中草药黄芩样品（河北、山西各2份）于80℃干燥至恒重，粉碎过孔径0.25mm筛得待测样品.用分析天平称取待测样品1g于圆底烧瓶中，加入45mL 60%乙醇溶剂，加热回流1.5h，将回流液倒入锥形瓶中；再次向圆底烧瓶加入45mL体积分数60%乙醇溶剂，回流1.5h，合并2次回流液，用少量溶剂洗涤圆底烧瓶和残渣，洗涤液合并入回流液，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，补加溶剂至刻度，摇匀.

按本实验选定的最佳实验条件测定样品中黄芩苷的含量，结果如表1，并与高效液相色谱法测定结果（面积归一法）进行对比，结果比较满意.另选取山西2样品在其中分别加入一定量的黄芩苷标准品进行回收率实验，结果如表2，准确度良好.

表1 4种黄芩样品中黄芩苷含量的测定Tab.1 Determination results of baicalin in scutellaria

表2 回收率测定Tab.2 Recovery test

3 结论

基于黄芩苷对鲁米诺－过氧化氢－氢氧化钠化学发光体系具有强抑制作用，建立了中草药黄芩中黄芩苷含量的检测方法，该方法灵敏度高，线性范围宽，操作简便.能满足快速分析的要求.

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