升结肠支架置入腹膜炎脓毒症模型的应用研究

陈海鸣，李学明，刘志坚，邹俊，李江涛，王联群

(南昌大学第一附属医院普外科，南昌330006)

脓毒症(sepsis)是外科极为常见的一种疾病，无论在发达国家还是发展中国家都是最常见的。 脓毒症病情凶险，病死率高，治疗成本高昂，发病率为每年70-240 人/10 万[1，2]，且呈逐年增长，估计到2020 年将新增约100 万脓毒症病例[3，4]。 脓毒症的发病机制十分复杂， 构建出理想的临床相关性脓毒症模型也就一直成为脓毒症研究的难点[5-7]。 本研究采用升结肠支架置入腹膜炎(colon ascendens stent peritonitis，CASP)模型，为研究脓毒症的发病机制提供理想的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 健康清洁级Balb/c 雄性小鼠共60 只，6-8 周龄，体重23-27 g/只，实验前所有小鼠适应性饲养1 周以适应环境。实验小鼠分5组，正常对照组，假CASP 组，CASP 组，其中CASP组按照支架的直径不同分为3 组：CASP 14GA 组[BD14GA(2.0×45mm2, 270 ml/min)]，CASP 16GA 组[BD16GA(1.7×45mm2, 180 ml/min)]，CASP 18GA 组[BD18GA(1.2×45mm2, 80 ml/min)]，每组动物12 只。

1.2 CASP 模型的制作 3 组CASP 模型分别采用静脉输液的18GA、16GA 和14GA3 种规格BD 针做插管支架， 从尖端环形切掉塑料圆管2mm 距离切端1cm 处用剪刀压榨一小沟， 但不切破塑料壁管壁备用。 抽取20 g/L 戊巴比妥钠，按50mg/kg 进行小鼠腹腔麻醉，沿腹中线切开腹腔，用棉签仔细地将盲肠、末端回肠、升结肠从腹腔轻轻拔出，距盲肠末端15mm， 用BD 针支架离4-0 薇乔线1-2mm 戳穿升结肠并进入结肠1cm， 用4-0 薇乔线缝合固定在升结肠肠壁上， 用棉签朝着塑料支架仔细挤出肠内容物， 直到支架的末端有一点粪便流出，把内脏放回腹腔，腹腔给予37℃的0.5ml 生理盐水复苏，关闭腹膜、皮肤。假CASP 组将塑料支架用缝线固定在升结肠系膜后将结肠回纳入腹腔，其余手术过程同CASP 组。 正常对照组为不做任何操作组。

1.3 观察指标 (1)术后一般表现；(2)不同管径支架的CASP 模型的生存时间及生存率；(3)各器官HE染色行组织病理学的检测；(4) 腹腔分泌物微生物实验室检查。

1.4 统计学分析 采用SPSS15.0 软件包进行统计学分析，应用Kaplan-Meier 方法和Log-rank 检验评价各小组生存率，P<0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 术后一般表现 12h 后CASP 各组均逐渐出现竖毛、蜷缩、少动、少食、呼吸减弱、体温下降，严重者可见眼角分泌物较多及颤抖， 但CASP18GA 组的症状出现时间最晚，症状最轻， CASP16GA 组的症状出现时间其次， 症状较重，CASP14GA 组的症状出现时间最早，症状最重。

2.2 不同管径支架的CASP 模型的生存时间 术后18h 开始观察到小鼠死亡，CASP 各组小鼠的生存时间取决于置入支架的管径， 置入支架管径越小生存时间越长， 其中CASP14GA 组小鼠平均存活时间为(28.800±2.752)h，CASP16GA 组小鼠平均存活时间为(84.200±21.758)h，CASP18GA 组小鼠平均存活时间为(113.200±21.270)h。 应用Log-rank检验进行生存分析显示不同管径CASP 实验组间有 显 著 性 差 异 (n=10，P=0.009，χ2=9.531)，CASP 14GA 组、CASP16GA 组、CASP18GA 组与假CASP组和正常对照组有显著性差异(n=10，P<0.001，χ2=74.524)。 见表1。

表13 种管径支架的CASP模型的生存时间比较

2.3 CASP 实验组各器官HE 染色 (1)肺脏：CASP实验组肺间隔明显增宽，肺泡壁小血管扩张充血，多灶出血，炎细胞浸润；(2)肝脏：肝脏汇管区增宽，小叶间血管扩张，炎性细胞浸润；(3)肠：CASP 实验组小肠粘膜可见回肠黏膜糜烂坏死， 肠腔内大量的炎性渗出物和脱落坏死的肠黏膜上皮， 绒毛明显萎缩，间质血管扩张，大量的炎性细胞浸润；(4)肾脏：肾小球毛细血管袢扩张充血，球囊腔狭窄。肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性。 肾间质水肿，血管扩张充血；(5)脾脏：脾窦增宽，扩张充血，炎细胞浸润，局部灶性出血。 白髓淋巴组织增生，淋巴滤泡形成；(6)心脏：心肌片状水肿，心脏间质炎性细胞浸润，间质血管充血。

2.4 腹腔分泌物微生物实验室检查 假CASP 组、正常对照组均未检测到细菌生长，CASP 实验组腹腔内分泌物培养均检测到典型的肠道细菌如革兰阴性大肠埃希氏菌、杆菌种、肠球菌等。

3 讨论

尽管近十年来脓毒症实验与临床研究方兴未艾，但脓毒症的致病机制仍未阐明[5，7]。 脓毒症的动物模型的构建大大促进了人们对脓毒症发病机制的认识。 其中盲肠结扎穿孔术模型(cecal ligationperforation，CLP) 被认为是进行脓毒症研究的金标准[8-9]。 自1978 年以来得到广泛的应用，然而研究发现该模型仍具有自身的缺陷， 主要表现为CLP模型在穿孔后包裹感染灶，使得感染局限化，有的甚至完全恢复， 从而不会进展到脓毒症及脓毒症休克。 为此，本研究采用升结肠支架置入至腹膜炎的脓毒症动物模型。

CASP 模型构建是将一个固定管径的支架植入鼠的升结肠， 使粪便持续渗漏到腹膜腔中并形成肠道细菌感染，导致腹腔脓肿和弥漫性腹膜炎，病理变化与临床上肠瘘的病理变化过程相似，都是破坏宿主屏障， 造成细菌易位， 引发炎症的模型。 本研究分别采用3 种不同管径的支架构建CASP 模型，小鼠均表现明显的脓毒症及脓毒性休克的症状，出现竖毛、蜷缩、呼吸减弱、体温下降等症状，小鼠腹腔有明显的炎症征象，小肠部分坏死发黑，腹腔炎症严重，明显渗液，腹腔内分泌物培养出肠道细菌， 进一步组织病理切片结果显示小肠黏膜明显坏死脱落，绒毛萎缩，心、肺、肾、脾脏有大量的炎性细胞浸润等炎症表现，CASP 模型各组小鼠的生存时间及炎症程度取决于置入支架的直径， 支架直径越大炎症越重。 本研究结果显示CASP 模型可以弥补CLP 模型持续性腹腔内感染不足的缺点，重现了急性多细菌性脓毒症腹膜炎的发生、发展过程，对于探讨脓毒症的病理生理学及机制的研究无疑具有重要意义。 本实验操作简单，具有可重复性，可以模仿人类弥漫性腹膜炎疾病过程， 适用于外科脓毒症的研究。

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