芦丁鼠李糖苷酶水解反应液中鼠李糖的分离纯化

张 美 超，刘 廷 强，王 东 明，金 凤 燮，鱼 红 闪

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

鼠李糖作为一种单糖，是甘露糖6位的一个羟基被氢取代最后变成—CH3的衍生物［1］，它在自然界主要以L 型存在。鼠李糖在细菌和植物中分布最为广泛，主要以与其他糖类或非糖类结合成多糖、糖苷或植物胶的形式存在于植物或细菌中。它可以作为药物的中间体［2］、合成强心药物、合成香料Furaneol［3－4］，也可与其他物质反应形成风味物、用作甜味剂［5－6］、还可作为肠道渗透测试剂使用［7］，并具有明显的抗癌的作用［8］。

生产鼠李糖的传统方法是将天然植物中含有鼠李糖基的大分子天然苷类化合物，进行酸碱水解后，通过分离纯化技术获得鼠李糖纯品。但是由于鼠李糖多与其他单糖共存于天然苷类化合物中，酸碱水解后，产物含有多种单糖，不利于鼠李糖后续的分离纯化，而且该法对环境污染大，因此不适宜大量制备。生物酶法因其具有水解特异性好、环境友好等特点，为鼠李糖的制备提供了新的思路。已有文献报道从自然界筛选菌株与天然植物中的有效成分共发酵从而转化生成鼠李糖的工艺，李玉山等［9］利用酵母发酵，从芦丁水解液中制备L－鼠李糖，其质量浓度可达9.52g／L；魏胜华等［10］也利用酵母发酵转化柚皮苷得到了高纯度的鼠李糖。本实验室前期已筛选出一种芦丁－α－鼠李糖苷酶，该酶能特异性水解芦丁上的鼠李糖苷键，生成异槲皮苷和鼠李糖［11］。本论文通过大孔吸附树脂，结合结晶法，对芦丁水解产物进行分离纯化，从而制备高纯度的鼠李糖，为生物转化法大量生产鼠李糖提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

鼠李糖、芦丁、槲皮素、异槲皮苷样品，美国Sigma公司；菌种Absidiasp.R9g，大连工业大学生物工程学院菌种保藏所；薄层层析板Silica Gel－60－F254，德国Merck 公司；SP207 大孔吸附树脂，日本三菱化成工业公司。

1.2 方 法

1.2.1 大孔吸附树脂分离酶解产物

采用由日本三菱化成工业公司生产的Sepabeads SP207 大孔吸附树脂，它以聚苯乙烯基苯为基体，并在苯乙烯基体上接了一个溴，非常适合分离芦丁、异槲皮苷等极性不大的芳香类化合物。24g芦丁经酶解后，酶解液反复上样，薄层层析跟踪检测，直至异槲皮苷被充分吸附为止。对吸附达饱和的SP207大孔吸附树脂柱，用去离子水充分洗涤，收集鼠李糖粗液，进行减压浓缩，即为鼠李糖粗糖液。

1.2.2 鼠李糖的精制

取浓缩后的鼠李糖粗糖液，分别配制糖溶液质量浓度为0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10g／mL的鼠李糖溶液各4 mL，并放于干燥器中静置结晶。定期观察晶体的生长状态，待晶体析出，分别收集晶体，干燥。

1.2.3 鼠李糖的检测方法

1.2.3.1 薄层层析法（TLC）检测

用微量点样器吸取标准品及样品，点样于薄层层析板上，将点好样品的薄层层析板放入层析缸中展开。糖类物质：展开剂为V（正丁醇）∶V（吡啶）∶V（水）＝6∶4∶1，显色剂为苯酚－硫酸（3g苯酚加5mL浓硫酸，再加95mL无水乙醇）。黄酮类物质：展开剂为V（乙酸乙酯）∶V（丁酮）∶V（甲醇）∶V（水）＝10∶7∶1∶1，于紫外灯下观察。比较样品点与标准品点位置可知样品中所含成分。

1.2.3.2 高效液相色谱法（HPLC）检测

分别取20μL 鼠李糖和葡萄糖标准品溶液（1.0mg／mL）和待测样品溶液（1.0 mg／mL）进行HPLC检测。通过待测样品HPLC图谱与鼠李糖标准品及葡萄糖标准品的HPLC图谱的出峰时间比对来确定样品的组分。HPLC 条件如下：色谱柱，Kromasil NH2（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为V（乙腈）∶V（水）＝80∶20，体积流量为1 mL／min，柱温为35 ℃，进样量为20μL，载气为氮气，体积流量为2L／min，载气压力为0.1 MPa，ELSD 的漂移管温度为80 ℃。

1.2.3.3 DNS测糖法

配制1mg／mL的鼠李糖溶液25mL，分别取1、2、3、4、5mL于5支刻度管中，并分别用去离子水定容至10 mL，即为标准品鼠李糖梯度溶液。以标准糖浓度作纵坐标，光密度OD540nm为横坐标，作标准曲线。样品测定参照标准曲线测定步骤，并做3个平行实验。通常所测样品的吸光值为0.2～0.8，有较好的线性趋势，因此糖液如果浓度过高，需要稀释后再进行测定，以减小误差。

2 结果与讨论

2.1 SP207大孔吸附树脂分离RhaR酶反应液

24g芦丁经酶水解后，采用SP207大孔吸附树脂对水解液中的异槲皮苷和鼠李糖进行初步分离。如图1 可知，经SP207 大孔吸附树脂吸附后，水洗脱溶液中主要含有鼠李糖，几乎不含有异槲皮苷，说明SP207大孔吸附树脂法分离鼠李糖和异槲皮苷的效果较好，分离得到的鼠李糖粗糖液中不含有异槲皮苷。水洗脱液经浓缩后，经DNS法测得粗糖液中鼠李糖的质量为4.18g，得率为17.4%。

图1 大孔吸附树脂分离酶反应产物的TLC检测Fig.1 TLC pattern of separation of enzymatic products by macroporous resin

2.2 鼠李糖的精制

将鼠李糖粗糖液分别配制不同浓度的鼠李糖溶液，于添加变色硅胶的密闭容器中静置结晶，观察晶体的生长状态、晶体形态，如表1所示。由表1可知，当糖质量浓度较小时，不利于形成晶核，所以无法结晶。随着糖质量浓度的增加，溶液的过饱和状态越来越高，有利于晶体的析出，出晶时间也随之加快，晶体得率也随之提高；当糖质量浓度过高、达到饱和状态时，糖溶液的黏度过大反而会抑制晶体析出，晶体得率反而下降，甚至无法析出晶体。因此糖质量浓度应在操作条件允许的范围内取最大值。从鼠李糖结晶溶液中挑取部分晶体放置在Motic AE31荧光倒置显微镜下观察并拍摄晶体形态，结果见图2。

表1 鼠李糖晶体表观形态及结晶得率数据Tab.1 Surface morphology and crystallization yield of rhamnose

由图2及干品数据可知，当鼠李糖水溶液到达其过饱和度开始析出晶体时，在一定的时间范围内，糖质量浓度为0.1～0.5g／mL 的鼠李糖溶液均能析出晶体，只是形成的晶体多为细碎较小的颗粒状；当糖质量浓度为0.4g／mL 时，晶体颗粒较为适中，透光率也较好；当糖质量浓度大于0.4g／mL时，晶体颗粒越来越大，透光率相对降低，干燥后的晶体表面能观察到有色素附着。

鼠李糖液质量浓度、结晶速率和质量之间有着密切联系，随着糖质量浓度的升高，有利于糖液快速达到过饱和状态，加快结晶速率，提高了晶体得率。但是当糖质量浓度过高时，破坏了溶液的动态平衡，结晶速率和结晶率反而降低。同时，糖质量浓度过高时，溶液中的杂质也容易析出，造成了晶体析出时伴随着晶体表面上杂质的附着，影响了晶体的质量。

2.3 高效液相色谱测定纯度

配制1.0 mg／mL 的鼠李糖标准品溶液和1.0mg／mL的葡萄糖标准溶液，并以大批量结晶所得晶体作为待测样品配制1.0mg／mL 的待测样品溶液。分别取20 μL 进行HPLC 检测，HPLC检测图谱见图3，所得数据如表2 所示。由图3和表2数据可知，结晶样品经HPLC 检测均为单一峰，且保留时间均与鼠李糖标准品出峰保留时间相近，而在葡萄糖标准品的出峰保留时间处无峰出现，说明结晶样品中已不含葡萄糖，而为纯度较高的鼠李糖晶体，纯度为99.0%。

表2 鼠李糖结晶样品HPLC图解析Tab.2 HPLC pattern analysis of rhamnose samples

3 结 论

在生物酶法转化芦丁研究基础之上，采用SP207大孔吸附树脂法对酶解产物中鼠李糖进行分离，其中24g芦丁的水解产物经分离可得到鼠李糖的质量为4.18g，得率为17.4%。分离得到的糖液进行浓缩后可直接进行结晶精制，当浓缩至0.4g／mL 时达到过饱和状态，结晶所得晶体颗粒饱满，无色透明，纯度可达99.0%。该研究方法分离效果好，鼠李糖得率较高，且操作简单，具有一定的工业化应用前景。

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