我国不同产地赤霞珠挥发性香气成分差异分析

孙莎莎，范文来，*，徐 岩，李记明，，于 英

（1.教育部工业生物技术重点实验室，江南大学酿酒科学与酶技术研究中心，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡214122；2.张裕集团公司技术中心，山东烟台264001）

赤霞珠是世界著名的酿酒红葡萄品种之一，以其易种植、适应性强、着色与品质良好、酒质优等特点，而受到葡萄酒生产者的热爱[1]。赤霞珠也是我国主要的酿酒红葡萄品种之一，我国葡萄种植区相对集中在气候和土壤适宜的地区，形成了黄土高原、新疆、渤海湾和华北地区等著名的酿酒葡萄生产区域[2]。由于气候、土壤、地质等地域因素的影响，从而使不同产地的赤霞珠葡萄在香气构成上产生了差异[3]，最终影响葡萄酒的特性和品质[4]，因此，研究不同产地葡萄的香气成分特点对葡萄酒酿造具有重要指导意义。

目前，研究葡萄中挥发性香气成分的方法主要有液液萃取（LLE）、同时蒸馏萃取（SDE）、顶空固相微萃取（HS-SPME）、搅拌棒吸附萃取（SBSE）等技术[5]，而利用HS-SPME及气相色谱质谱（GC-MS）分析葡萄中的芳香性成分，是葡萄分类、质量控制以及了解葡萄香气特点的重要手段[6-10]。国内外对赤霞珠葡萄的研究取得了一定的成果，2010年Fan等[11]比较了赤霞珠在内的四种酿酒葡萄中挥发性香气成分的特点，2011年Forde等[12]研究了赤霞珠及其酿造的葡萄酒的挥发性成分和感官属性间的关系，2013年Jiang等[13]对我国四个葡萄种植区的赤霞珠和蛇龙珠葡萄酒进行了比较研究，但是针对不同产地间赤霞珠葡萄香气成分差异研究的报道较少。

本实验主要采用HS-SPME和GC-MS分析新疆石河子、宁夏青铜峡、河北怀来和山东烟台四个产地的赤霞珠葡萄果实中的挥发性香气成分，并运用方差分析（ANOVA）和判别分析（DA）找到产地间具有显著性差异的成分，为区分不同产地的赤霞珠葡萄提供理论依据，并为提高4个产地葡萄品质及确定其酿造工艺提供指导性数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2011年26个赤霞珠酿酒红葡萄样品（包括新疆石河子3个样品、宁夏青铜峡16个样品、山东烟台5个样品和河北怀来2个样品） 均由张裕公司技术中心提供；乙酸乙酯（纯度99%，CAS：141-78-6）、丁酸乙酯（纯度99%，CAS：105-54-4）、3-甲基丁醛（纯度97%，CAS：590-86-3）、1-己醇（纯度99%，CAS：111-27-3）、3-甲基丁醇（纯度99%，CAS：123-51-3）、顺-3-己烯-1-醇（纯度99%，CAS：928-96-1）、1-辛烯-3-醇（纯度98%，CAS：3391-86-4）、2-乙基-1-己醇（纯度99%，CAS：104-76-7）、苯甲醛（纯度99%，CAS：100-52-7）、1-辛醇（纯度98%，CAS：111-87-5）、顺，反-2，6-壬二烯醛（纯度95%，CAS：557-48-2）、4-萜品醇（纯度99%，CAS：20126-76-5）、里那醇（纯度98%，CAS：78-70-6）、苯乙醛（纯度97%，CAS：122-78-1）、α-松油醇（纯度98%，CAS：10482-56-1）、β-大马酮（纯度98%，CAS：23726-93-4）、己酸（纯度99%，CAS：142-62-1）、苯甲醇（纯度99%，CAS：100-51-6）、苯酚（纯度98%，CAS：108-95-2）、顺-2-戊烯-1-醇（纯度95%，CAS：1576-95-0）、反-2-庚烯醛（纯度97%，CAS：18829-55-5）、反-2-己烯-1-醇（纯度96%，CAS：928-95-0）、辛醛（纯度99%，CAS：124-13-0）、反-2-己烯醛（纯度99%，CAS：6728-26-3）、1-戊醇（纯度99%，CAS：71-41-0）、水杨酸甲酯（纯度99%，CAS：119-36-8）、p-伞花烃（纯度95%，CAS：99-87-6）、d-柠檬油精（纯度96%，CAS：138-86-3）、2-庚醇（纯度99%，CAS：543-49-7）、壬醛（纯度97%，CAS：124-19-6）、乙酸（纯度98%，CAS：64-19-7）、糠醛（纯度96%，CAS：98-01-1）、反，反-2，4-庚二烯醛（纯度96%，CAS：5910-85-0）、丁二酸二乙酯（纯度98%，CAS：123-25-1）、顺-香叶基丙酮（纯度97%，CAS：689-67-8）、β-苯乙醇（纯度98%，CAS：60-12-8）、壬酸（纯度98%，CAS：112-05-0）和乙醇（液相色谱纯） 均购自Sigma-A ldrich公司；2-辛醇（纯度96%，CAS：6169-06-8） 购自Fluka公司；辛酸（纯度98%，CAS：124-07-2） 购自吴江慈云香料香精有限公司；己醛（纯度98%，CAS：66-25-1）、癸醛（纯度99%，CAS：112-31-2） 购自北京北大正元科技有限公司。

6890N-5975型气相色谱质谱联用仪 美国Agilent公司；50μm/30μm CAR/DVB/PDMS（2cm）萃取头美国Supelco公司；Autosamp ler自动进样系统 德国Gerstel公司；Avallyi J-E高速离心机 美国BECKMAN公司；AS2060B型超声波清洗器 天津Autoscience公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 取完全成熟的葡萄样品用液氮速冻，于-20℃保藏。实验时称取冷冻储藏的葡萄样品50g，室温解冻3h，去梗放入塑封袋中，称重，加入葡萄1%重量的无水CaCl2，破碎榨汁（籽不破坏），去籽后将果汁和果皮移入50m L小烧杯中冰水浴（0℃）超声浸取20m in，4℃下5000r/min离心10m in，量取8m L葡萄汁加入顶空瓶中，加2.4g NaCl和4μL 2-辛醇内标（浓度为10.76mg/L），盖上顶空瓶盖，用于GC-MS检测。

1.2.2 GC-MS条件

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱：DB-FFAP（60m×0.25mm×0.25μm，Agilent）；升温程序：50℃保持1m in，以4℃/m in升至230℃，保持5m in；载气（He）流速2m L/m in；不分流进样。

1.2.2.2 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z 35～350。1.2.3 HS-SPME萃取条件 采用Fan等的方法[11]，50μm/30μm CAR/DVB/PDMS（2cm）萃取头（Supelco，Inc.，Bellefonte，PA），预热5m in，60℃下对挥发性成分萃取45m in。

1.2.4 挥发性成分定性与定量

1.2.4.1 物质定性 有标准品的化合物，采用标准品定性。未知化合物的定性采用将其图谱与NIST 05质谱库（107K compounds）和W iley Library（320K compounds，version 6.0）相比较，保留匹配度大于800（最高值为1000）的物质作为化合物定性鉴定结果。

1.2.4.2 物质定量 每种待测物质分别对应于内标作标准曲线，经过GC-MS检测后，将待测物质与内标的相对峰面积之比代入相应的标准曲线方程，计算出待测物质的含量。采用选择离子（SIM）计算每种待测物质的峰面积。

1.2.5 统计分析 本实验用SPSS 19软件对数据进行统计分析，通过ANOVA分析出不同产地葡萄中有明显差异的挥发性成分，并运用DA对葡萄产地进行判别。

2 结果与讨论

2.1 赤霞珠葡萄中挥发性成分定量结果分析

利用顶空固相微萃取法提取赤霞珠葡萄中的香气成分，进行GC-MS分析，共定性定量了47种化合物（见表1），其中包括4种酯类、8种醛类、8种醇类、6种芳香族化合物、3种挥发性有机酸、10种萜烯类化合物、8种C6化合物，不同产地的赤霞珠葡萄中检测出的香气成分种类基本相同。根据定量结果，反，反-2，4-庚二烯醛、顺，反-2，6-壬二烯醛、1-辛醇、1-戊醇、辛酸、d-柠檬油精、β-大马酮、1-己醇、己酸、己醛、反-2-己烯醛、反，反-2，4-己二烯醛、2-己烯酸在四个产地的赤霞珠中有较高的浓度（达到mg/L），是赤霞珠中主要的风味物质。

总体上，在不同产地的赤霞珠葡萄中，各类化合物的总含量各有特点。新疆石河子产地萜烯类化合物含量偏高，宁夏青铜峡含有较多酯类、醇类，山东烟台产地醛类、C6化合物含量较高，而河北怀来挥发性有机酸浓度较高。总体上，宁夏青铜峡产地的挥发性成分总含量是偏高于其他产区的，推测与宁夏产区优越的环境条件有关，其自然条件与波尔多相媲美[14]，气候干燥，昼夜温差大，光照充足，土质原始，土壤有机质含量高，砂砾结合型土质透气性极佳，因此葡萄香气发育完全。

2.2 四个产地赤霞珠葡萄挥发性成分方差分析

不同产地的赤霞珠葡萄中检测出的香气骨架基本一致，但由于气候、土壤、地质等地域因素的影响，不同产地的葡萄在香气成分含量上产生了差异[15]。对四个产地赤霞珠葡萄样品进行方差分析（见表1），可以看出，有8种香气物质含量在产地间具有显著差异，包括1种醛类（反-2-庚烯醛），1种醇类（顺-2-戊烯-1-醇），2种芳香族化合物（苯酚、苯甲醇），1种挥发性有机酸（辛酸），1种萜烯类化合物（β-大马酮），2种C6化合物（己醛、反-2-己烯醛），而定量的4种酯类化合物均没有显著性差异。

续表

显著性差异成分中含量较高的香气成分包括辛酸、β-大马酮、己醛和反-2-己烯醛。

辛酸在河北怀来赤霞珠中的含量显著高于新疆石河子产地。辛酸在赤霞珠葡萄中的含量较高，不同产地赤霞珠中辛酸的浓度范围在0.36～2.33mg/L。辛酸呈现干酪气味[11]，酸类物质是葡萄中酸臭气味的主要来源，主要是在浆果转色前由植株绿色部分的呼吸作用产生[16]。

β-大马酮（糖果香[11]）在石河子地区的赤霞珠中葡萄中含量显著高于烟台和怀来，由表1可见不同产地间的10种萜烯类化合物中，只有β-大马酮的含量具有显著性差异，但从总体上看，不同产地间葡萄的萜烯类化合物的构成差别不大。已有研究显示，葡萄中萜烯类化合物的种类受葡萄的生长区域影响小，同一品种不同产区的葡萄，萜烯类化合物的组成非常相近，实验结果与这一结论相似[17]。

己醛和反-2-己烯醛两种高浓度的C6化合物，在不同产地之间有显著差异，主要表现在石河子和烟台产地的己醛显著高于青铜峡和怀来产地，烟台产地的反-2-己烯醛含量显著高于怀来产地。葡萄中的C6化合物主要贡献青草、树叶气味[11]，己醛和反-2-己烯醛在不同产地赤霞珠中含量分别高达2.63mg/L和6.73mg/L，是葡萄中重要的风味化合物[18]。

较低浓度的显著性差异成分包括顺-2-戊烯-1-醇，反-2-庚烯醛、苯酚和苯甲醇。

顺-2-戊烯-1-醇（呈蘑菇气味[19]），在新疆石河子和河北怀来地区的赤霞珠葡萄中含量显著高于宁夏青铜峡，而反-2-庚烯醛（呈现脂肪气味，青草香[20]），在河北怀来地区的含量显著高于其他产地。芳香族化合物中苯酚和苯甲醇（分别呈酚臭和花香[11]）含量有显著差异，山东烟台产地苯酚含量显著高于其他产地，且烟台的苯甲醇含量也显著高于河北怀来。

可见，新疆石河子地区赤霞珠风味物质特点是具有较高浓度的己醛和β-大马酮，宁夏青铜峡含有较低浓度的顺-2-戊烯-1-醇、己醛，山东烟台有较高浓度的苯甲醇、苯酚、己醛和反-2-己烯醛，而河北怀来有较高浓度的反-2-庚烯醛、辛酸。因此，不同产地赤霞珠主要风味物质特征在于：石河子产地具有较高浓度的β-大马酮，青铜峡产地具有较低浓度的己醛，烟台产地的反-2-己烯醛含量比较高，而怀来产地的辛酸浓度比较高。

2.3 判别分析

通过判别分析区分四个赤霞珠葡萄产地，判别分析证明，通过方差分析得到的8种成分可以将已有赤霞珠葡萄的产地正确的区分开。

将方差分析得到的显著性差异成分作为判别分析成分，所得的标准化典型判别函数系数见表2，判别分析得到三个典型判别函数，前两个函数的累计方差贡献率为88.1%。

表2 4个产地赤霞珠葡萄中香气物质判别函数的标准系数Table2 Standardized canonical discriminant function coefficients for aroma compounds in grapes

从表3可知，利用筛选出的变量可以对25个葡萄样品的产地进行100%的正确分类，交叉验证分组案例中有88.5%的样品进行了正确分类。图1为不同产地赤霞珠葡萄的判别分析结果，各样品都比较紧密的围绕在质心周围，可以看出山东烟台、新疆石河子、宁夏青铜峡与河北怀来四个产地的葡萄都可以较好的区分。

可见通过方差分析的到的显著性差异成分具有很好的代表性，为不同产地间赤霞株葡萄的鉴别提供了理论依据。

3 结论

本文采用HS-SPME技术结合GC-MS分析技术测定了张裕四大产地的赤霞珠酿酒红葡萄样品，定量了47种化合物，其中包括4种酯类、8种醛类、8种醇类、6种芳香族化合物、3种挥发性有机酸、10种萜烯类化合物、8种C6化合物，其中宁夏青铜峡产地测得的香气成分总含量最高，不同产地间各类香气物质含量各有特点。

图1 赤霞珠葡萄产地判别函数图Fig.1 Plotof discriminant functions

基于对张裕四大产地赤霞珠葡萄挥发性成分检测结果，通过方差分析从47种成分中筛选出了反-2-庚烯醛、顺-2-戊烯-1-醇、苯酚、苯甲醇、辛酸、β-大马酮、己醛、反-2-己烯醛，这8种具有显著性差异的成分。不同产地赤霞珠主要风味物质特征在于：新疆石河子产地具有较高浓度的β-大马酮，宁夏青铜峡具有较低浓度的己醛，山东烟台产地反-2-己烯醛含量比较高，而河北怀来产地的辛酸浓度比较高。

以这8种成分作为判别分析成分，进而通过判别分析对葡萄样品的产地进行了产地判别。结果表明，产地判别的准确率可以达到100%，交叉验证准确率达到88.5%，比较客观的反映了样品的真实情况，充分说明这些成分具有产地特征性，可以通过比较香气成分对四个产区的赤霞珠进行区分，从而为其产地鉴定提供了理论依据。而要建立更具应用性与准确性的产地判别模型，还需要增大样本量获得更多的信息进行进一步的研究。

表3 判别分析分类结果a，cTable3 Classification results of DAa，c

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