响应面优化超声波法提取黑豆异黄酮的工艺研究

豆亚静，张晓龙，常丽新，闫金萍，吴 丹

(1.河北联合大学轻工学院，河北唐山063000; 2.河北联合大学生命科学学院，河北唐山063000)

黑豆，为豆科植物大豆的干燥种子，兼有药食两用的作用。我国各地均有栽培，尤以山西、河北、陕西较多。黑豆含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、胡萝卜素、微量元素和粗纤维。《本草纲目拾遗》记载黑豆“服之能益精补髓，壮力润肌，发白后黑，久则转老为少，终其身无病”。现代科学研究表明黑豆具有降血脂、抗氧化、养颜美容的效果［1］。异黄酮是黄酮类化合物中的一种，主要存在于豆科植物中。大豆异黄酮是大豆生长过程中产生的次生代谢产物。20世纪90年代，对大豆异黄酮的研究成为世界性的研究热点。研究发现，大豆异黄酮具有防止骨质疏松症、抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、预防心血管疾病、改善妇女更年期综合症及雌激素样等作用［2］。超声波法是利用超声波产生的机械作用、扩散、热效应以及空化作用加速生物细胞中有效成分的扩散和浸出。具有提取时间短、有效成分提取率高、成本低、低温保护热敏性成分、污染小等优点。目前，关于黑豆异黄酮的研究报道极少，本文以乙醇作为溶剂，采用超声波法通过单因素实验和响应面优化，考察了影响黑豆异黄酮提取的因素，确定了最佳提取工艺。并与振荡提取法进行了比较，同时测定了不同产地黑豆异黄酮的含量，探索不同品种黑豆的黑豆异黄酮提取量的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆 产自吉林、河北、陕北、江西、山东等地黑豆洗净在60～65℃烘干粉碎过筛分为20、40、60、80、100、120目备用;金雀异黄酮标准品 洛阳市创伟化玻有限公司;95%乙醇 天津市永大化学试剂公司。

722型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司;BS-124S型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司;101-1AB型干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;SK5210HP型超声波清洗器 上海康华生化仪器制造厂;KDF-2311型多功能食品粉碎机 天津市达康电器有限公司;标准分析筛 浙江上虞市华丰五金仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黑豆异黄酮工艺流程图 黑豆粉末→乙醇浸泡→超声波提取→过滤→测定异黄酮含量

1.2.2 绘制标准曲线 准确称取金雀异黄酮标准品5.00mg，用95%乙醇溶解，定容至50m L容量瓶中。准确吸取标准溶液0.00、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50m L的溶液于10m L容量瓶中，再分别加入5.0m L 95%乙醇，然后用蒸馏水定容。在波长259nm下测定吸光度。以金雀异黄酮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

得出标准曲线回归方程:Y=1606.9966X-0.013 (R2=0.9980)

1.2.3 异黄酮提取率的计算 黑豆异黄酮提取液在波长259nm下测定吸光度，根据标准曲线，得异黄酮的浓度［3］。

1.2.4 单因素实验设计 分别以乙醇浓度、粒度、液料比、提取时间、温度、提取次数为单因素进行实验，探讨其对黑豆异黄酮提取率的影响。

称取8份粒度为80目的黑豆粉5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液，在室温下浸泡2h，然后在50℃下超声处理20min。

称取颗粒粒度为20、40、60、80、100、120目黑豆粉各5.0000g，按液料比20∶1(m L/g)加入60%乙醇溶液，在室温下浸泡 2h，然后在 50℃下超声处理20m in。

称取9份100目黑豆粉5.0000g，按液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1加入60%乙醇溶液，在室温下浸泡 2h，然后在 50℃下超声处理20m in。

称取7份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室温下浸泡2h，在温度20、30、40、50、60、70℃，超声处理20m in。

称取6份100目黑豆粉5.0000g，按液料比45∶1加入60%乙醇溶液，在室温下浸泡2h，在50℃超声处理10、20、30、40、50、60m in。

称取 100目黑豆粉 5.0000g，按液料比 45∶1 (m L/g)加入60%乙醇溶液，在室温下浸泡2h，在50℃超声处理50m in，冷却，过滤，再同样条件下分别超声处理1、2、3、4、5次。

1.2.5 响应面分析 在单因素实验结果基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，选择液料比、提取时间、温度进行三因素三水平的中心组合实验见表1，利用Design-expert软件进行响应面分析，确定超声波法提取黑豆异黄酮的最佳工艺参数。

表1 三因素三水平中心组合实验因素水平编码表Table1 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 乙醇浓度对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图1可以看出，随着乙醇浓度的增加，黑豆异黄酮的提取率随之增加。在乙醇浓度高于60%以后曲线平缓，提取率的增加相对较小。因为黄酮类化合物易溶于乙醇，乙醇浓度高有利于颗粒中物质渗透溶解，而乙醇浓度过大时，蛋白质，糖类等易溶于水的大分子会在乙醇溶液中发生凝聚，使提取液变稠，影响了黄酮的快速扩散溶出，提取率的增加减少。从经济方面考虑，选择60%为最适乙醇浓度。

图1 乙醇浓度对黑豆异黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentrations on yield of isoflavone from black soybean

2.1.2 颗粒粒度对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图2可以看出，随着粒度增加，黑豆异黄酮提取率也随之增加，粒度为100目时，异黄酮提取率最大;粒度大于100目时，随着粒度的增加异黄酮提取率下降。这说明，在一定粒度范围内，随粒度的增加黄酮的溶解性增强，但粒度过细，会使黄酮在样品颗粒表面的吸附增加，从而降低其在溶剂中的溶解性。因而选择100目为最适粒度。

2.1.3 液料比对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图3可知，随着液料比的增加，黑豆异黄酮提取率也随着增加，液料比为45∶1(m L/g)时，异黄酮的提取率达到最大值;之后随着液料比的增大，异黄酮提取率随之下降，原因是液料比过大使溶剂的量过多时，会导致其他杂质的过多溶出，从而影响异黄酮溶解。因而最适液料比选择为45∶1(m L/g)。

图2 颗粒粒度对黑豆异黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of particle sizes on yield of isoflavone from black soybean

图3 液料比对黑豆异黄酮提取效果的影响Fig.3 Effect of liquid to solid ratios on yield of isoflavone from black soybean

2.1.4 提取温度对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图4可以看出，随着提取温度的升高，黑豆异黄酮提取率也随之升高。温度为50℃时异黄酮提取率最大，温度大于50℃时，提取率反而下降。可能是由于高温会破坏异黄酮的结构，影响异黄酮的提取效果。因此选择50℃为最适提取温度。

图4 温度对黑豆异黄酮提取效果的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.1.5 提取时间对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图5可见，随着提取时间的增加，黑豆异黄酮的提取率会随之增加。增加提取时间会使物质能更加充分的溶解，使颗粒中物质溶解完全，但在50m in后提取率的增加相对较小，只会增加提取的成本，从经济以及操作方面考虑，因此选择50m in为最适提取时间。

图5 时间对黑豆异黄酮提取效果的影响Fig.5 Effect of time on yield of isoflavone from black soybean

2.1.6 提取次数对黑豆异黄酮提取效果的影响 由图6可以看出，随着提取次数的增加异黄酮的提取率也增加。提取次数会使颗粒中物质溶解更为完全，提取更为充分，从经济与操作方面考虑。因此选择2次为最适提取次数。

图6 提取次数对黑豆异黄酮提取效果的影响Fig.6 Effect of extraction times on yield of isoflavone from black soybean

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 回归模型的建立与分析 根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，结合单因素实验的结果，选取影响黑豆异黄酮提取率的主要因素(液料比、时间、温度)进行三因素三水平中心组合实验，利用响应面分析方法优化的黑豆异黄酮提取工艺参数，实验方案与结果见表2。

根据表2数据，利用软件Design Expert进行液料比、提取温度、提取时间三个因素对黑豆异黄酮提取率影响的回归分析，建立三元二次响应面回归方程:

从表3可知，回归方程极显著，预测值与实验值具有高度的相关性(R2=0.9841)。拟合程度＞90%，说明模型能够反映响应值的变化，说明这种实验方法可靠，使用该方程模拟真实的三因素三水平的分析可行。失拟项差异不显著，说明残差均由随机误差引起;由表3中可知，液料比、提取温度的一次项和二次项对黑豆异黄酮的提取率的影响极显著或显著;提取时间的二次项对黑豆异黄酮的提取率的影响极显著，而一次项不显著。表明实验因素对响应值不是简单的线性关系，而是一种非线性关系。因此，可以用此模型来分析和预测超声波法提取黑豆异黄酮的工艺条件。而各因素的交互作用对黑豆异黄酮提取率的影响不显著。

表2 三因素三水平中心组合实验方案及结果Table2 Three factors and three levels of central composite experiment scheme and results

2.2.2 黑豆异黄酮提取工艺响应面分析与优化 响应曲面反映了当液料比、提取温度、提取时间三个因素的任意变量取零点水平的时候，其它两个因素的交互作用对黑豆异黄酮提取率的影响情况。曲面陡表明该因素对提取率的影响显著，曲面平缓表明该因素对提取率的影响不显著;等高线的形状反映两因素交互作用的强弱，椭圆形表明交互作用强，影响显著，圆形则相反;等高线密集表明对提取率影响较大，稀疏表明影响较小。

2.2.2.1 液料比与提取温度的交互作用 从图7可看出，液料比的曲面较陡，温度的曲面较平缓，说明液料比对异黄酮提取率的影响显著，提取温度的影响不显著;图7中等高线沿液料比轴向较温度轴向密集，说明液料比对异黄酮提取率的影响比温度大;等高线为圆形，说明两因素的交互作用较弱，对黄酮提取率的影响不显著。

图7 液料比与提取温度的交互作用对提取率的影响Fig.7 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction temperature on yield of isoflavone from black soybean

2.2.2.2 液料比与提取时间的交互作用 从图8可看出，液料比的曲面较陡，提取时间的曲面较平缓，说明液料比对异黄酮提取率的影响显著，提取时间的影响不显著;图8中等高线沿液料比轴向较时间轴向密集，说明液料比对异黄酮提取率的影响比时间大;等高线为圆形，说明两因素的交互作用较弱，对异黄酮提取率的影响不显著。

2.2.2.3 提取温度与提取时间的交互作用 从图9中可看出，提取温度和提取时间的曲面都比较平缓，说明这两个因素对异黄酮提取率的影响均不显著;图9中等高线沿温度轴向较时间轴向密集，说明温度对异黄酮提取率影响比时间大;等高线为圆形，说明两因素的交互作用较弱，对黄酮提取率的影响不显著。

图8 液料比与提取时间的交互作用对提取率的影响Fig.8 Interaction effect of liquid to solid ratios and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

图9 提取温度与提取时间的交互作用对提取率的影响Fig.9 Interaction effect of the extraction temperature and extraction time on yield of isoflavone from black soybean

2.3 黑豆异黄酮最佳提取条件的确定和验证实验

综上所述，在选取的各因素范围内，影响黑豆异黄酮提取效果的因素由强到弱依次为液料比、温度、提取时间。根据回归模型通过Design-Expert软件分析得出，以60%乙醇为提取剂、颗粒粒度100目、连续提取2次条件下，超声波法提取黑豆异黄酮的最佳条件为液料比 45.74∶1(m L/g)、提取时间50.86min、温度为52.01℃，黑豆异黄酮提取率的预测值为1.891%。考虑到实际情况，确定最佳提取工艺条件为:液料比46∶1(m L/g)、温度52℃、提取时间51m in。在此条件下进行三次平行实验，实际平均值为1.883%，与预测值偏差较小，说明该回归方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对超声波法提取黑豆异黄酮的工艺进行回归分析和参数优化。

2.4 不同产地的黑豆异黄酮的测定

超声波提取法:准确称取粒度为100目的样品一定量，按液料比46∶1加入60%乙醇，室温浸泡2h，52℃超声处理51m in，连续处理2次。

由表4可以看出，在最佳提取条件下对不同产地的黑豆异黄酮含量进行了测定，结果显示产地为吉林的黑豆异黄酮含量最高。

表4 不同产地黑豆异黄酮的测定Table4 Determination of isoflavone from black soybean in different producing areas

3 结论

以产于吉林的黑豆为材料，采用超声波法对黑豆异黄酮的提取工艺进行了研究。在单因素实验的基础上，利用Design Expert软件进行实验设计，采用响应面法对黑豆异黄酮提取的工艺条件建立二次多项式数学模型，对各因素对响应值的影响进行分析。结果表明，实验误差小，模型拟合度高，考虑到实际情况，最佳的提取工艺条件可校正为在乙醇浓度60%、粒度100目、液料比46∶1(m L/g)、温度52℃、提取时间51m in、提取2次，此工艺条件下黑豆异黄酮的提取率为1.883%，与预测值1.891%相差较小。此实验表明超声波提取黑豆异黄酮比传统的振荡提取法要更经济、快捷、高效，在异黄酮提取应用范围内越来越受到重视。同时根据最佳提取工艺测定了其他四个产地的黑豆异黄酮含量，结果表明，产于吉林的黑豆异黄酮含量最高，产于山西的黑豆异黄酮含量最低。

［1］张晨，杨晓泉，唐传核.大豆异黄酮的热水提取及其纯化工艺的优化［J］.食品研究与开发，2005，26(5):77-80.

［2］李南薇，唐晓恩，钟银链.大豆异黄酮提取和应用研究进展［J］.广东农业科学，2010(5):118-120.

［3］王莹，翟登攀，马冬云，等.超声波及微波提取豆粕中总黄酮的工艺优化［J］.佳木斯大学学报:自然科学版，2009，27 (3):468-470.