促红细胞生成素对兔局灶性脑缺血皮质区神经肽Y 表达的影响

熊云彪，杨承勇，黄生炫，王 超，杨 恒，司书喜，刘窗溪 (贵州省人民医院神经外科，贵州贵阳550002)

急性脑血管病变又称脑卒中，是一种常见的致死性和致残性疾病，与心脏病和恶性肿瘤共同构成人类三大致死疾病。新近研究发现，神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)不仅与高血压形成有关，而且与急性脑梗死缺血-复流过程中神经元损伤、变性、程序性凋亡的病理发生发展过程密切相关［1-3］。近年来的体内外实验研究均证实了促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)对脑缺血后神经元功能的恢复具有重要的保护作用［4］。但EPO 对神经元的具体保护机制尚未被揭示，有关脑缺血EPO 干预后脑组织内NPY 含量改变的关系研究更是甚少。因而，本实验通过建立兔局灶性脑缺血模型，研究在EPO 干预下家兔脑缺血损伤不同时间段NPY 的表达变化，为中枢神经系统损伤后修复机制及治疗策略的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性新西兰兔 42 只，体质量 2.0 ～2.5 kg，由贵阳医学院动物实验中心提供。随机分为脑缺血组(18 只)、EPO干预组(18 只)和假手术组(6 只)，其中脑缺血组和EPO 干预组又根据手术后取材时间的不同分6 h、12 h、24 h 组。假手术组于术后24 h 取材。

1.2 药品及试剂

重组人红细胞生成素注射液(recombinant human erythropoietin，rHuEPO，商品名:环尔博)，北京四环生物工程制品厂生产，产品批号:20090406。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的制备及处理 采用开颅法［5］制作大脑中动脉(MCA)缺血的模型:取新西兰兔1 只行腹腔注射麻醉。麻醉平稳后俯卧位固定于手术台上。在手术显微镜下于左眶上缘做切口，依次切开头皮，在左颞顶骨开取骨窗暴露左侧大脑半球，找到位于嗅束及大脑下静脉之间的一段大脑中动脉(MCA)，将吸有50%FeCl3小片定量滤纸敷在MCA 上，持续30 min 后去掉滤纸。用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合后，回笼饲养。观察动物有无偏瘫症状。假手术组不用FeCl3滤纸覆盖。EPO 干预组术后30 min 予457 IU/kg EPO 腹腔内注射。根据Zea Longa 评分法选择成功的动物模型。神经功能评分:无神经功能缺损症状，活动正常为0 分;不能完全伸展对侧前爪为1 分;行走时向偏瘫侧转圈为2 分;向偏瘫侧倾倒为3 分;不能自行行走，意识丧失为4 分。本实验选取的动物模型均为1 ～3 分。成功的动物模型分别于术后 6、12、24 h 取脑缺血组和EPO 干预组脑组织标本，假手术组于术后24 h 取脑组织，多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，制成4 mm 厚的连续切片，每例每个观察指标均观察3 张切片以上。

1.3.2 染色方法 HE 染色按常规操作步骤进行;免疫组织化学SABC 法染色，显示NPY 阳性细胞。主要步骤为:切片常规化蜡至水，10%H2O210 min，正常山羊血清(1︰50)封闭20 min，滴加 NPY 抗血清(1︰1 000)(SIGMA 公司提供)，4 ℃ 过夜，羊抗兔 IgG(1︰100)37 ℃ 孵育 20 min，SABC 复合物(1︰100)37 ℃孵育 20 min，DAB 显色，苏木精复染细胞核，中性树胶封片。方法对照:PBS 缓冲液代替特异性抗血清，余步骤同上。

1.3.3 图像分析 随机选取假手术组、脑缺血和EPO 干预组脑组织切片各5 张，在40 倍物镜下，每张切片随机选取5 个视野，分别计数每个视野内有核NPY 阳性细胞数。

1.3.4 统计学处理 应用 SPSS 11.5 软件包对实验数据进行单因素方差分析，统计学处理。实验数据用平均值±标准差(±s)表示。P ＜0.05 差异具有显著性。

2 结果

2.1 HE 染色光镜观察

假手术组:大脑皮质区神经细胞形态、结构正常，胞浆丰富、均匀，核圆形或类圆形，核仁明显(图1a)

脑缺血组:多数神经细胞形态不完整，胞浆内尼氏体分解，核浆分界不清，细胞核固缩，染色较深，核仁不清，细胞周围中重度水肿(图1b)。

EPO 干预组:部分神经细胞结构欠完整、尼氏体分解，细胞核固缩，部分核浆分界及细胞核尚可辨认，核仁不清，细胞周围中度水肿 (图1c)。

2.2 免疫组织化学SABC 法光镜观察

免疫组织化学染色结果显示:假手术组大脑皮质NPY 阳性细胞数量较少，棕黄色的阳性反应产物表达在胞质内(图2a)。方法对照切片未见阳性反应细胞。缺血后6 h，脑缺血组、EPO 干预组缺血侧皮质NPY 阳性细胞数量较假手术组增多(图2b);脑缺血组、EPO 干预组NPY 阳性细胞数量随缺血时间延长显著增多，免疫染色较深。与脑缺血组相比，EPO干预组 NPY 阳性细胞数量于缺血后 12、24 h 有所下降(图2c ～f)，但均多于假手术组。

2.3 图像分析

图1 家兔脑皮质区 HE 染色(×400)

脑缺血6 h 后，单纯脑缺血与EPO 干预家兔大脑皮质NPY阳性细胞数量与假手术组相比均有所增多(P ＜0.05)，且随缺血时间延长，阳性细胞数量呈现逐渐上升趋势(P ＜0.05)。脑缺血12 h 后，EPO 干预组NPY 阳性细胞数量较脑缺血组有所减少(P ＜ 0.05)，缺血 24 h 后 2 组细胞数量变化更加明显(P ＜0.01)，见表1。

表1 大脑皮质NPY 有核阳性细胞数比较(±s)

表1 大脑皮质NPY 有核阳性细胞数比较(±s)

* :与假手术组 6 h、脑缺血组 6 h、EPO 干预组 6 h 比较，P ＜0.05;#:与脑缺血组 12 h、EPO 干预组 12 h 比较，P ＜0.05;△:与脑缺血组 12 h 比较，P ＜0.05;▲:与脑缺血组 24 h 比较，P ＜0.01

组别 n 6 h 12 h 24 h假手术组6 0 0 3.16 ±1.73脑缺血组 18 8.81 ±1.02 15.70 ±1.25* 19.31 ±1.61＊△EPO 干预组 18 7.84 ±1.31 11.24 ±2.46＊△ 13.02 ±4.35* #▲

3 讨论

NPY 由36 个氨基酸组成，属胰多肽家族，主要分布于中枢神经系统及外周器官，具有广泛的生物学活性。研究显示NPY 对脑血管有较强的收缩作用，在体内的缩血管效应可使局部脑血流减少50%［6］。老年短暂性脑缺血发作患者血清NPY 水平显著高于正常人［7］。Yu 等［8］对 450 例脑缺血中风患者 NPY 基因分析表明在NPY 启动子区域C 端等位基因-399 T/C 多态现象对于缺血性发作是一种独立的危险因子，提示NPY 可能参与脑中风的病理学机制。本实验通过建立家兔大脑中动脉闭塞脑缺血模型，研究缺血侧皮质区脑组织内NPY 的表达情况，结果显示随脑缺血时间延长，NPY 表达逐渐增高。这与上述学者的研究结果类似。推测是由于脑缺血缺氧，交感-儿茶酚胺系统兴奋，使副交感神经释放NPY 增加。增多的NPY 可能通过以下途径参与缺血性脑损伤的病理过程:①不断刺激血管收缩，进一步降低脑血流，加重缺血性脑损伤;②通过激活神经元型一氧化氮合酶(NOS)产生NO增多 ，加重缺血半暗带区的代谢紊乱［9］。

图2 家兔脑皮质区NPY 阳性细胞 (SABC 法×400)

EPO 是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白，是一种造血细胞生长因子，主要用于治疗多种原因所致的贫血，在调节红细胞生成的过程中起着重要作用。EPO 及其受体在人类和啮齿类动物脑组织中广泛表达，通过自分泌或旁分泌方式对神经细胞发挥内源性保护作用。近年来的动物实验和体外细胞培养研究均证实EPO对脑缺血具有神经保护作用［10-11］。本实验中，脑缺血组家兔缺血侧皮质多数神经细胞变性坏死，形态不完整，胞浆内尼氏体分解，核浆分界不清，细胞核固缩，细胞周围中重度水肿，EPO 干预后，脑组织水肿减轻，变性坏死的神经细胞明显减少。这些结果表明EPO 可以抑制细胞凋亡的发生，并能减轻脑组织水肿，与上述研究结果一致。

结果显示EPO 治疗后家兔缺血侧皮质区NPY 表达有所降低，提示EPO 对缺血缺氧脑组织的保护作用可能与NPY 的表达有关。关于EPO 神经保护作用的具体机制目前尚不清楚，秦川等［12］研究表明EPO 预处理在心肌H/R 损伤中具有显著的抗氧化作用。有研究显示EPO 可使神经元内诱导型NOS 水平降低，并通过抑制NO 介导的自由基产生或拮抗其毒性，从而发挥抗氧化作用。NPY 则通过激活NOS 使NO 增多，加重脑缺血损伤。但EPO 是否通过调节NO 这一途径间接调节NPY 的含量还需进一步深入研究。有关EPO与 NPY 的关系研究甚少，Kondo 等［13］研究癫痫发作模型大鼠EPO 的作用时发现无论是内源性还是外源性EPO 均可以调节癫痫发作的严重程度并保护海马区神经元，其可能机制包括阻断海马区致癫痫细胞的形成和调节 NPY 的释放。Gebhard 等［14］研究证实暴露于CO 中的去肾神经大鼠其EPO 分泌显著增高，且增高效应能被NPY 阻断。提示在CO 暴露情况下，与肾神经相关的EPO 分泌增多的反应可能通过NPY 受体途径。因此我们推测，脑缺血后EPO 调节NPY 的释放可能是其神经保护作用机制之一。

［1］Duszczyk M，Ziembowicz A，Gadamski R，et al.Changes in the NPY immunoreactivity in gerbil hippocampus after hypoxic and ischemic precon ditioning［J］.Neuropeptides，2009，43(1):31 -39.

［2］杨海林，孙树林，徐淑珍.74 例缺血性脑血管病诊断治疗分析［J］.局解手术学杂志，2007，16(3):184.

［3］Smia?owska M，Domin H，Zieba B，et al.Neuroprotective effects of neuropeptide Y-Y2 and Y5 receptor agonists in vitro and in vivo［J］.Neuropeptides，2009，43(3):235 -249.

［4］Chatagner A，Hüppi PS，Ha-Vinh Leuchter R，et al.Erythropoietin and neuroprotection ［J］.Arch Pediatr，2010，17 (S3):78 -84.

［5］刘 健，李 祥，李健龙，等.氯化铁致兔大脑中动脉脑缺血模型的建立［J］.中华实验外科杂志，2001，(4):382.

［6］Sperk G，Hamilton T，Colmers WF.Neuropeptide Y in the dentate gyrus［J］.Prog Brain Res，2007，163:285 -297.

［7］王 英，周武娟.老年短暂性脑缺血发作与hs-CRP 和NPY 关系的探讨［J］.放射免疫学杂志，2011，24(1):31 -32.

［8］Yu JT，Yu NN，Gao SS，et al.Neuropeptide Y polymorphisms and ischemic stroke in Chinese population ［J］.Clin Chim Acta，2010，411(3 -4):242 -245.

［9］谭 峰，顾 卫，万赛英，等.环维黄杨星D 对高血压大鼠脑缺血再灌注神经肽mRNA 表达的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志［J］.2008，10(11):852 -855.

［10］Jerndal M，Forsberg K，Sena ES，et al.A systematic review and meta-analysis of erythropoietin in experimental stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2010，30(5):961 -968.

［11］史志勤，王维平，于江华，等.重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马p2Akt 和XIAP 的影响［J］.第三军医大学学报，2009，31(1):1453 -1457.

［12］秦 川，肖颖彬，陈 林，等.促红细胞生成素预处理在大鼠心肌缺氧复氧损伤中的抗氧化效应［J］.局解手术学杂志，2011，20(1):71 -73.

［13］Kondo A，Shingo T，Yasuhara T，et al.Erythropoietin exerts anti-epileptic effects with the suppression of aberrant new cell formation in the dentate gyrus and upregulation of neuropeptide Y in seizure model of rats［J］.Brain Res，2009，1296:127 -136.

［14］Gebhard C，Petroktistis F，Zhang H，et al.Role of renal nerves and salt intake on erythropoietin secretion in rats following carbon monoxide exposure［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，319(1):111 -116.