非水滴定法测定甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸含量的研究

■郭晓明 陆圣杰 王佳亮 许甲平朱 贤 邓志刚

（1.上海应用技术学院化学与环境工程学院，上海 201418;2.上海德邦牧业有限公司，上海 201108）

相对于无机盐形式的微量元素而言，氨基酸螯合物可以大幅度提高动物对微量元素的吸收利用率，同时具有杀菌、促酶活等功能，因此，近年来已经成为饲料添加剂的重要组成部分[1]。甘氨酸亚铁能够提高动物体内的血红素含量和转铁蛋白的含量，对动物的缺铁性贫血具有很好的预防和治疗作用。近期的研究还表明，甘氨酸亚铁能显著改善仔猪的生长性能[2]，提高蛋鸡的产蛋率和改善蛋品质[3]。因此，在众多的氨基酸微量元素螯合物中，甘氨酸亚铁的研究和使用最为广泛。

甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量能体现生产过程中甘氨酸与亚铁离子的螯合率，在一定的前提条件下也能反映甘氨酸亚铁的稳定性，是评价生产工艺和产品性能的一项重要指标。当前国标(GB/T 21996—2008)有关甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的测定采用非水滴定法。然而，化验人员普遍反映在测试过程中存在滴定终点快速返色导致无法准确判断终点的问题。

本文简单介绍了非水滴定原理，分析了国标(GB/T 21996—2008)所制定方法中存在的问题，在此基础上，提出了可行的改进方法，并用实验进行了验证。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

循环水式真空泵（河南巩义予华仪器厂），恒温水浴槽（HHS-21，上海博迅医疗设备有限公司），电子天平（BS224S，北京赛多利斯仪器系统有限公司），量程为50 ml的酸式滴定管和量程为5 ml的微量滴定管（上海申玻仪器公司）。高氯酸、冰醋酸、醋酸酐、邻苯二甲酸氢钾、甘氨酸均购自国药集团化学试剂公司，高氯酸是浓度为70%的水溶液，其它试剂为分析纯；结晶紫指示剂按照国标GB/T 603的方法配制，浓度为0.5 g/l，甘氨酸亚铁（甘氨酸与亚铁离子的摩尔比为1∶1）由作者实验室自行制备。

1.2 实验方法

1.2.1 高氯酸标准溶液的配制与标定

1.2.1.1 溶液的配制

量取0.7～0.9 ml浓度为70%的高氯酸与500 ml冰醋酸混合均匀，加入30 ml醋酸酐摇振，使其充分混合，再用冰醋酸稀释至1 000 ml。静置过夜，使醋酸酐与水充分反应，此溶液贮藏于棕色瓶中，临用前标定。

1.2.1.2 溶液的标定

精确称取邻苯二甲酸氢钾（110℃恒重）约0.5 g，溶于50 ml冰醋酸中，加入结晶紫指示剂4～5滴，用高氯酸的冰醋酸溶液滴定至蓝绿色。

1.2.2 甘氨酸与甘氨酸亚铁在冰醋酸中的溶解度测定

在烧杯中加入100 ml冰醋酸并置于温度为25℃的恒温水浴槽中。称取一定质量的甘氨酸于称量瓶中，分多次从中移取适量甘氨酸至冰醋酸中，搅拌，直至有不溶物出现为止，称量剩余甘氨酸质量，用减量法求出冰醋酸中已溶解的甘氨酸质量。计算出25℃下，甘氨酸在冰醋酸中的溶解度。采用相同的方法测定甘氨酸亚铁在冰醋酸中的溶解度。

1.2.3 甘氨酸亚铁中游离甘氨酸的分离

称取0.5 g甘氨酸亚铁样品溶于一定量的冰醋酸中，搅拌5 min，再浸渍10 min，减压过滤，用少量冰醋酸洗涤滤饼，滤液用于滴定分析。

1.2.4 游离甘氨酸的测定

1.2.4.1 未预先分离游离甘氨酸（国标GB/T 21996—2008的方法）：称取0.5 g甘氨酸亚铁（精准至0.000 2 g），置于250 ml锥形瓶中，加入30 ml冰醋酸，搅拌5 min，再浸渍10 min，加入4～5滴结晶紫指示剂，溶液此时显紫红色。用高氯酸标准溶液滴定，溶液由紫红色变为蓝绿色为滴定终点。同时做空白实验。

1.2.4.2 预先分离游离甘氨酸：先按1.2.3所述方法分离甘氨酸亚铁样品中的游离甘氨酸，在滤液中加入指示剂，用高氯酸滴定。

2 结果与讨论

2.1 非水滴定法测定氨基酸简介（以甘氨酸为例）

氨基酸分子中含有-NH2和-COOH，为一两性物质。在水中，甘氨酸的酸性(羧基上的氢Ka=2.5×10-10)和碱性(氨基作为碱的Kb=2.2×10-12)都很弱，无法用酸碱滴定法准确滴定[4]。根据酸碱理论中的区分效应原理，甘氨酸在非水介质冰醋酸中相当于一种强碱，用HClO4(在冰醋酸中也显强酸性)作滴定剂，可实现甘氨酸的准确滴定。该方法属于酸碱滴定范畴，滴定反应式如下：

滴定采用结晶紫作指示剂，当pH值大于3.0时指示剂显紫色，当pH值小于等于2.0时显蓝绿色。高氯酸滴定冰醋酸中的甘氨酸时，滴定终点的颜色由紫红色变为蓝绿色。

2.2 国标法测定游离甘氨酸过程中指示剂返色的原因

作者按国标GB/T 21996—2008的方法对甘氨酸亚铁中的游离甘氨酸进行了测定，结果发现，滴定终点极易发生返色现象（约1～2 s即返色，随着滴定继续进行返色时间逐步延长），导致难以判断滴定终点。同时，作者发现滴定过程中的滴定速度、锥形瓶的摇荡幅度和摇荡频率也对指示剂变色点的出现有很大影响。这与众多生产和使用甘氨酸亚铁的实验室化验人员反映的情况一致。

就固体状态的甘氨酸亚铁产品而言，游离甘氨酸即未与金属离子发生螯合的那部分甘氨酸，这是控制生产工艺和评价产品性能的重要指标，也是检测的目标物。然而，当把甘氨酸亚铁产品加入到冰醋酸中时，甘氨酸亚铁存在解离平衡，如反应②所示：

此时，游离甘氨酸包括两部分，一是产品中未发生螯合反应的甘氨酸，二是在醋酸中解离出来的甘氨酸。当滴入高氯酸时，两部分游离甘氨酸都与高氯酸结合生成高氯酸盐（如反应①所示），过量的高氯酸使结晶紫由紫红色变为蓝绿色。但是，滴定过程中甘氨酸浓度的降低打破了反应②的平衡，甘氨酸亚铁会进一步解离产生游离甘氨酸，即反应②的平衡向右移动。平衡移动产生的游离甘氨酸又与高氯酸结合，导致指示剂重新由蓝绿色变为紫红色，即滴定终点返色。由于在滴定过程中反应②的平衡移动速度较快，在滴定速度较慢的情况下，滴定终点严重滞后。此时，高氯酸不仅滴定了产品中未发生螯合反应的甘氨酸，也滴定了已发生螯合的部分甘氨酸。

由以上分析可知，采用非水滴定方法测定甘氨酸亚铁产品中的游离甘氨酸时，应先将游离甘氨酸从产品中分离出来。

2.3 甘氨酸亚铁和游离甘氨酸的分离

从氨基酸螯合物产品中分离出游离氨基酸通常有凝胶过滤色谱法[5]和离子交换法[6]。这些方法操作繁琐，条件控制要求高，且后续的检测通常需要大型仪器。本文利用甘氨酸和甘氨酸亚铁的溶解度的差异来实现两者的分离。

由于甘氨酸亚铁和甘氨酸均易溶于水[7]，且后续滴定是非水环境，因此首先排除水作分离溶剂的可能。甘氨酸亚铁和甘氨酸在甲醇、乙醇中的溶解度均很小[8]，因此也不可采用醇类作分离溶剂。按照1.2.2的步骤，作者测定了25℃时甘氨酸和甘氨酸亚铁在醋酸中的溶解度。结果显示，甘氨酸的溶解度为440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亚铁的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于两者的溶解度差异很大，可以通过溶解过滤的简单办法实现两者的分离，具体过程如1.2.3所述。作者认为，甘氨酸之所以在醋酸中有较大的溶解度是因为甘氨酸的羧基和氨基均可与醋酸分子之间形成氢键，而甘氨酸亚铁中相应的基团已和亚铁离子发生了配位，消弱了和醋酸形成氢键的能力。

2.4 样品分析

采用冰醋酸作溶剂分离游离甘氨酸与甘氨酸亚铁，然后滴定溶解于冰醋酸中的甘氨酸，结果如表1所示。滴定终点没有返色现象，且滴定过程中滴定速度对滴定终点没有影响。测试结果的RSD为3.7%，表明该方法的测试精密度较好。在甘氨酸亚铁产品中加入1.00、1.50和5.00 mg/g的分析纯甘氨酸按此改进后的方法进行加标回收实验，回收率为95.4%～102.8%(见表2)，表明该方法的准确度也较好。该方法能够满足实际样品分析检测的要求。

表1 甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的测试结果

表2 加标回收实验结果

表1还给出了未预先分离情况下样品的测试数据（滴定速度为每秒1～2滴，指示剂30 s内不返色为终点），游离甘氨酸的平均值为4.55 mg/g，相对标准偏差为10.1%。与预先分离测试结果相比，游离甘氨酸的测定值显著偏大。这是因为在未预先分离游离甘氨酸的情况下，高氯酸不仅滴定了产品中未发生螯合反应的甘氨酸，也滴定了已发生螯合的部分甘氨酸，造成了很大的系统正误差。测试结果的精密度下降则是由于滴定终点存在返色现象使终点的判断不精确所致。显然，不预先分离甘氨酸亚铁中的游离甘氨酸直接进行非水滴定的测试方法无法达到检测目的，不能满足分析检测要求。

3 小结

采用非水滴定方法测定甘氨酸亚铁产品中游离甘氨酸的含量，必须先把游离甘氨酸与甘氨酸亚铁分离。否则，测试结果存在很大的系统正误差且精密度低，不能满足分析检测要求。利用游离甘氨酸和甘氨酸亚铁在冰醋酸中的溶解度差异可以实现两者的分离。采用非水滴定方法对预分离后的游离氨基酸进行了测定，RSD为3.7%，表明测试精密度较高；对甘氨酸亚铁产品进行了加标回收实验，回收率为95.4%～102.8%，表明该方法的准确度良好。改进后的方法能够满足实际样品分析检测的要求，且有望用于其它氨基酸螯合物中游离氨基酸的测定。