饲料添加剂牛至油中香芹酚和百里香酚含量的测定

■窦茂鑫 赵 迪 侯永清 吴 涛

（动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

长期以来，饲料中添加抗生素为集约化畜牧业的发展做出重大贡献的同时也带来了诸多负面影响，如容易造成仔猪的抗药性、毒副作用和体内残留及环境污染等[1]。新型药物添加剂牛至油，以其绿色、环保、广谱抗菌、促生长、无残留及不易产生耐药性等特点，在未来养猪业上的应用前景非常看好[2]。本研究建立了饲料药物添加剂牛至油中香芹酚和百里香酚的检测方法，本方法操作简便、准确可靠、选择性好，为牛至油的检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

高效液相色谱仪（Waters 1525型，配Waters 2489检测器）、超声波清洗器、电子天平（精度0.000 1 g）。

1.2 试验试剂

甲醇、冰醋酸为色谱纯，试验用超纯水；香芹酚标准品（Sigma公司，纯度≥99%），百里香酚标准品（Sigma公司，纯度≥99%）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(2)柱(粒度为5 μm，柱规格为250 mm×4.5 mm)，流动相：甲醇∶水∶冰醋酸=60∶4∶2，检测波长：274 nm，流速：1.0 ml/min，进样体积为20 μl，柱温30 ℃。

1.4 标准溶液的制备

精密量取香芹酚0.5 ml，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成香芹酚含量为1%的贮备液；精密称取百里香酚0.5 g，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10 mg/ml的百里香酚贮备液。然后用甲醇将香芹酚贮备液稀释成含量分别为（×10-3μl/ml）5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0的标准液，用甲醇将百里香酚贮备液稀释成浓度为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0和500.0 μg/ml的标准液。

1.5 样品溶液的制备

精密量取牛至油样品0.5 ml置于250 ml容量瓶中，加200 ml甲醇超声提取30 min，冷却后用甲醇定容，经过0.22 μm滤膜过滤后制供试样品溶液。

1.6 加样回收试验

精密量取5份已知含量的牛至油供试样品，分别添加已知含量的香芹酚和百里香酚标准品，测定两者的回收率和精密度。

2 结果与分析

2.1 色谱图

标准溶液的色谱图如图1所示。图1表明，香芹酚和百里香酚得到了很好的基线分离，峰形对称，无杂质峰干扰。

图1 香芹酚和百里香酚标准溶液色谱图

2.2 标准曲线的测定

将香芹酚和百里香酚一系列浓度的标准品溶液分别取20 μl进样，测定积分值，以峰面积为纵坐标，分别以香芹酚和百里香酚含量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。

香芹酚：Y=15 123X+22 670 R2=0.999 8；

百里香酚：Y=14 825X-15 883 R2=0.999 4。

结果表明，香芹酚在5.0～500.0×10-3μl/ml浓度范围内线性关系良好，百里香酚在1～500 μg/ml的浓度范围内也呈现良好的线性关系。

2.3 精密度试验

分别取0.1 μl/ml的香芹酚标准品溶液和100 μg/ml的百里香酚标准品溶液 20 μl进样，连续进样5次，测定峰面积如表1所示。求得香芹酚和百里香酚峰面积的RSD分别为0.39%和0.82%，说明此方法具有较好的精密度。

表1 香芹酚和百里香酚精密度试验（峰面积）

2.4 重复性试验

牛至油制成的5份牛至油供试样品中香芹酚含量和百里香酚含量如表2、表3所示。试验测得香芹酚和百里香酚的平均含量分别为37.81%、7.05 mg/ml，变异系数分别为0.91%、1.1%，说明方法重现性良好。

表2 牛至油中香芹酚含量测定试验

表3 牛至油中百里香酚含量测定试验

2.5 加样回收试验

精密量取5份已知含量的牛至油供试样品5 ml，分别置于5个50 ml容量瓶中，然后分别添加浓度为0.1 μl/ml的香芹酚标准液和50 μg/ml的百里香酚标准液，测得结果如表4、表5所示。香芹酚和百里香酚的平均回收率分别为98.2%、98.4%，RSD分别为1.0%、1.3%，结果说明该方法的回收率高。

表4 牛至油中香芹酚回收率测定试验

表5 牛至油中百里香酚回收率测定试验

3 讨论

牛至油具有抗菌、杀菌功能，因其具有较强的脂溶性和表面活性，与病原微生物的细胞膜有很强的亲和力，能使细胞膜的通透性增加，内容物流失从而杀灭病原微生物[3]。有研究报道[4-6]，牛至油的主要成分为香芹酚、百里香酚、对聚伞花素等，其中香芹酚和百里香酚抗菌活性最高。本研究建立了饲料药物添加剂牛至油中香芹酚和百里香酚的检测方法，本方法操作简便、准确可靠、选择性好，可作为控制牛至油质量的方法。

本试验选用甲醇超声提取30 min，采用Di⁃amonsil C18(2)柱分离，Waters 2489检测器检测，以甲醇-水-冰醋酸（60∶4∶2）为流动相，结果显示此方法使香芹酚和百里香酚得到很好的基线分离，且重复性好、回收率高，可以作为牛至油中香芹酚和百里香酚检测的标准方法。