饲料乳酸菌冻干工艺的探究

■樊 振 买尔哈巴·艾合买提 美合热阿依·木台力甫 乌斯满·依米提

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046）

在青贮饲料的生产中，乳酸菌起到了举足轻重的作用，它能在发酵过程中迅速繁殖并产生大量的乳酸和乙酸，进而迅速降低青贮环境的pH值，并结合周围的无氧条件抑制了霉菌、酵母菌等有害菌的活动，从而达到保持饲料营养品质和长期存贮的目的[1]。

然而，在实际生产中由于受路途遥远、试验条件差等客观因素的制约，乳酸菌青贮添加剂粉剂化显得尤为必要。在诸多菌粉制作技术中，真空冷冻干燥法生产的发酵剂由于含活菌数高、发酵活力强、遗传性稳定、便于储藏、携带方便、使用安全等优点而被广泛使用[2-3]。而关于乳酸菌冻干的报道，在食品方面较多，但在饲料上却鲜有提及。

要制作优良的冻干发酵剂，其中涉及两个关键：即增加菌液的浓缩程度和减少干燥致死的数量[4]。在制作冻干粉剂的过程中，菌体细胞的分离技术是一个重要的中间环节。离心分离时，由于离心力机械作用和离心时间的影响，如果离心条件掌握不当，菌体死亡率和损失率会随之增高，故而选用合适的离心条件是非常必要的[5]。冻干是一个多步骤过程，会产生多种应力，如低温应力、冻结应力和干燥应力等，会使细菌变性。然而冻干保护剂可以改变样品在冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止干燥和复水对细胞的损伤，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性[6]。

本文所选用菌株均为从吐鲁番地区玉米青贮饲料上分离得到。选用的保护剂为大分子保护剂、小分子保护剂和抗氧化物搭配使用，以期能得出保护效果最佳的保护剂配方。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

MRS培养基：用于以上菌株的增殖培养。

抗坏血酸、海藻糖、甘油均为分析纯，脱脂乳为市售脱脂奶粉。

仪器设备：真空冷冻干燥机、高速离心机。

1.2 试验设计

1.2.1 试验流程

单个菌落→活化→初次扩培→二次扩培→离心收集菌体→加入保护剂→活菌计数(cfu/ml)→分装预冻(-20℃，12 h)→冷冻干燥→复水处理(10%脱脂乳，2 h)→计活菌数(cfu/ml）→计算冻干存活率。

1.2.2 菌体的收集和细胞悬浮液的制备

离心条件的选择：为了使样品冻干时有足够的菌体，分别选择不同的转速和时间进行离心，然后通过测活菌数来确定收集高浓度菌体所需要的离心条件。

悬浮液制备：用以上方法得出的最佳离心条件将菌液离心后去上清液，然后将不同保护剂分别加入菌体沉淀中，悬浮液制备好后测活菌数。

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1.2.3 冷冻干燥存活率的测定

活菌数测定：吸取0.5 ml待测菌液用灭菌的生理盐水进行10倍梯度稀释，选择适当的稀释梯度，吸取200 μl菌悬液置于平板内，加入15 ml左右的MRS培养基混匀，每个稀释梯度3个平行。平板在37℃恒温培养箱培养48 h后，选择菌落数在30～300之间的平板进行计数。

存活率计算公式[7]：

2 结果与讨论

2.1 离心法收集菌体细胞

本试验用不同的离心力和不同的离心时间，筛选出了两株菌分别要获得最大活菌数所需的离心条件，试验结果如图1和图2所示。

图1 离心条件对植物乳杆菌离心效果的影响

图2 离心条件对肠膜状明串株葡聚糖亚种离心效果的影响

通过比较离心条件对两株菌离心效果的影响，可以得出两株菌均在5 000 r/min的条件下离心10 min，所得的活菌数最高。L.P（植物乳杆菌）活菌数可达1.14×1012cfu/g，而L.D(肠膜状明串株葡聚糖亚种)活菌数可达7.2×1011cfu/g。

在离心分离过程中，一方面，部分菌体残留于上清液中造成损失；另一方面，由于离心力的作用造成的机械损伤会使部分菌体死亡。如果离心工艺掌握不当，必然导致发酵剂中活菌含量的下降。田洪涛（1998）在离心双歧杆菌时发现，在采用“低速长时”或“高速短时”离心时，离心损失率明显下降，收获的活菌数最多[8]。本试验所得结果与其得出的结论基本一致。

2.2 正交试验优化冻干保护剂

本试验采用4因素3个水平的正交试验L9(34)来确定4种保护剂：海藻糖、脱脂奶粉、抗坏血酸和甘油的复合配方，正交试验的因素水平设计见表1，试验结果见表2和表3。如表2和表3所示，4种保护剂在单因素试验中都有很好的保护效果。

表1 正交试验因素水平设计

表2 植物乳杆菌冻干保护剂的筛选

表3 肠膜状明串株葡聚糖亚种冻干保护剂的筛选

由表2的试验结果可以看出，影响植物乳杆菌冻干存活率的因素从大到小为A＞B＞D＞C,脱脂乳的效果最为明显，甘油效果较差。通过优化冻干保护剂的正交试验结果，可以得到植物乳杆菌的最佳保护剂配方为：脱脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%，抗坏血酸3%（以上均为质量分数）。植物乳杆菌在使用此保护剂的情况下冻干存活率可达到88.21%。

由表3的试验结果可以看出，影响肠膜状明串株葡聚糖亚种冻干存活率的因素从大到小为A＞B＞D＞C,其中脱脂乳的效果最为明显，甘油效果较差。通过优化冻干保护剂的正交试验结果，可以得到肠膜状明串株葡聚糖亚种的最佳保护剂配方为：脱脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗坏血酸2%（以上均为质量分数）。肠膜状明串株葡聚糖亚种在使用此保护剂的情况下冻干存活率可达到90.02%。

保护剂可以减少冷冻干燥引起的微生物细胞的损伤。配制保护剂时应当注意保护剂材料的搭配[9]。一般来说，保护剂大体上可以分为两类：一类为小分子化合物，如氨基酸、醇类和糖类等；另一类为大分子物质，如蛋白质、可溶性淀粉等。原则上小分子保护剂搭配大分子保护剂就能获得良好的保护效果。

脱脂乳作为最常见的一种保护剂，其多种成分可以在冻干过程中起保护作用，如其中的乳清蛋白能够在菌体外形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可以固定冻干的酶类，防止由于细胞壁蛋白质的损坏而引起的胞内物质泄漏[10]。在本试验中，脱脂乳在两株菌的冻干过程中起的作用也最为明显。近年来，海藻糖的保护作用日益被人们所重视，关于海藻糖对生物分子的保护作用，大致有两种假说，一是“玻璃态”假说，该假说认为通过海藻糖玻璃化转变的趋势，使细菌在冷冻干燥过程中和复水过程中均处于液晶状态，在这种结构中，分子运动和分子反应非常微弱[11]。二是“水替代”假说，该假说认为当生物大分子失去包围在其表层以维持其结构和功能的水膜时，海藻糖能在失水部位以氢键形式连接，形成一层保护膜以代替失去的结构水膜，来维持生物大分子的空间结构[12]。而甘油作为一种小分子保护剂，冻干时在胞内起如下作用：一是改变了胞内的过冷状态，使胞内外压力接近，降低了细胞脱水缩皱程度和速度；二是小分子保护剂能顺利进出细胞，缓解了因复水引起的渗透性肿胀而带来的损伤。抗坏血酸作为一种抗氧化剂，能降低保护剂的氧化还原电位，并消耗试验过程中的部分氧气，防止对菌体有害的胺基羟基反应或氧化作用，保持了细胞活性并提高稳定性。

3 结论

通过优化冻干保护剂的正交试验结果，可以确定植物乳杆菌的最佳保护剂配方为：脱脂乳15%、海藻糖6%、甘油2%、抗坏血酸3%，此时植物乳杆菌的冻干存活率可达到88.21%。肠膜状明串株葡聚糖亚种的最佳保护剂配方为：脱脂乳15%、海藻糖6%、甘油1%、抗坏血酸2%，此时肠膜状明串株葡聚糖亚种的冻干存活率可达到90.02%。

本试验所选用的4种保护剂具有较好的互补作用，脱脂乳主要在细胞表面起保护作用；甘油能渗透到细胞内部；海藻糖在干燥过程中形成一种玻璃态，由于极高的黏度使得分子扩散系数很低，降低了细胞壁的通透性；最后结合抗氧化性能良好的抗坏血酸，使得乳酸菌在冻干后存活率大大提高，从而克服了如路途遥远、活菌数不足、饲养地区试验条件差等因素的制约，为青贮饲料添加剂在农牧区的推广提供了现实依据。