不同复合益生菌对锦江黄牛瘤胃体外发酵的影响

■刘明珠 瞿明仁 包淋斌 邬向东 钟启平

（1.江西农业大学江西省高校动物营养重点实验室，江西南昌 330045；2.江西宜春强微生物科技有限公司，江西宜春 336000）

微生态制剂以其天然、无毒、无副作用、无残留、安全可靠、不污染环境的优越性成为发展绿色畜禽产品和替代抗生素首推的饲料添加剂之一。我国农业部规定可用于生产微生态制剂的微生物有6种,即乳酸杆菌、乳酸链球菌、粪肠球菌 、芽孢杆菌、双歧杆菌和酵母菌[1]。本课题组研究发现乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，处理3 h，存活仍有95%以上（瞿明仁等，2012）[2]。大量研究证明,科学的复合制剂对动物有协同和互补作用。因此，本课题组在前期研究的基础上，以产乳酸粪肠球菌、酵母菌和芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）为主，配制了4种复合益生菌。本研究利用体外培养的方法，评定4种复合益生菌制剂对江西锦江黄牛瘤胃体外发酵培养的影响，以期筛选出最佳的复合益生菌组合，为在肉牛中的生产应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

复合益生菌由江西农业大学动物营养与饲料科学重点实验室与宜春强微生物科技有限公司联合研制和生产，代号分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，共4种。复合益生菌由产乳酸粪肠球菌、酵母菌和芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌）按一定比例和工艺制备而成，见表1。

表1 复合益生菌组成

1.2 试验动物与基础日粮

选用2头体重为(275±15)kg安装有永久性瘤胃瘘管的健康锦江黄牛，以供瘤胃液的采集。试验动物每天饲喂2次(08:00和18:00)，自由饮水。基础日粮为玉米-豆粕-稻草型日粮，按肉牛1.3倍维持需要配制，精粗比为60∶40，基础日粮组成和营养水平见表2。

表2 基础日粮组成及营养水平

体外培养试验设5个组，即不添复合益生菌的基础日粮为对照组，4个试验组分别添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ号复合益生菌，添加量均为在基础日粮中添加200 mg/kg。

1.3 体外培养试验

1.3.1 体外培养装置

体外批次培养装置参照卢德勋等[3]和程茂基[4]的方法进行。该装置主体为恒温水浴摇床，其水浴温度和震荡速率可调。培养瓶为瓶口安装有橡皮塞的150 ml奶瓶，橡皮塞上接有带三通阀的橡胶管，三通阀可打开和关闭，三通阀一端与25 ml医用玻璃注射器相连，注射器用于测定体外培养过程中的产气量。

1.3.2 瘤胃液采集

于晨饲前由2头锦江黄牛瘤胃内上下左右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位点采集足量瘤胃液，灌入经预热达39℃并通有CO2的灭菌清洁烧杯中，烧杯置于装有39℃蒸馏水的保温瓶中，灌满后立即盖好保温瓶盖子，迅速返回实验室，经4层纱布过滤后持续通入CO2气体5 min，然后迅速分装至已预热好并装有培养底物和人工唾液的培养瓶内(每个培养瓶加20 ml瘤胃液)。接通培养瓶和注射器，打开振荡开关，开始培养。

1.4 样品的预处理

培养24 h后，将培养瓶取出，立即测定其pH值，然后将培养物用纱布过滤，滤渣无损失地转移入100 ml大坩埚中，置于65℃烘箱中烘干，以测定干物质降解率。滤液转移至100 ml大离心管中，以1 500 r/min离心15 min，去除原虫和饲料大颗粒。取上清液保存，以备分析BCP浓度、NH3-N浓度和VFA浓度。

1.5 指标的测定

1.5.1 产气量

每隔30 min记录注射器的气体量，记录完后排气，累计培养24 h的总产气量。

1.5.2 瘤胃液pH值

培养24 h后立即用PHS-320酸度计（上海密通机电科技有限公司生产）直接测定。

1.5.3 瘤胃液NH3-N浓度

参照冯宗慈等的比色法进行测定[5]。

1.5.4 瘤胃液菌体蛋白（MCP）的测定

取经预处理去除原虫和饲料大颗粒的上清液10 ml，以16 000×g离心20 min，弃去上清液，沉淀的细菌部分加入9 ml、10%三氯乙酸溶液，混匀，再以4 000 r/min离心10 min，取沉淀物加入5%氢氧化钠溶解，然后稀释至25 ml。此稀释液又经4 000 r/min离心10 min，取上清液在紫外分光光度计上用280 nm和260 nm波长进行比色。应用下面公式求得细菌蛋白质含量：

细菌蛋白质含量（mg/ml）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀释倍数

1.5.5 瘤胃液VFA浓度

按照戈婷婷等[6]的气相色谱法进行测定。

1.6 数据处理

采用Excel 2003和Spss16.0软件对试验数据进行方差分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同复合益生菌体外培养产气量、pH值、

MCP含量、NH3-N浓度和干物质降解率

表3 不同复合益生菌制剂对培养液产气量、pH值、MCP含量、NH3-N浓度和干物质降解率影响

由表3可见，添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号复合益生菌和对照组的培养液pH值均在正常范围内。添加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌的24 h总产气量与对照组有显著的提高(P＜0.05)，各处理组间差异不显著(P＞0.05),但以Ⅱ号复合益生菌的产气量最高为170.50 ml；Ⅰ、Ⅱ号复合益生菌微生物蛋白含量极显著高于其他组(P＜0.01)，其中Ⅱ号复合益生菌的微生物蛋白含量最高达270.43 mg/100 ml，而且显著高于Ⅰ、Ⅲ号(P＜0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌氨态氮浓度极显著低于对照组和第Ⅳ号复合益生菌(P＜0.01)，Ⅳ号复合益生菌显著低于对照组(P＜0.05)；Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌干物质降解率极显著高于对照组(P＜0.01)。

2.2 不同复合益生菌制剂对瘤胃液挥发性脂肪酸浓度的影响（见表4）

表4 添加不同复合益生菌对瘤胃液挥发性脂肪酸浓度的影响

由表4可见，与对照组相比，Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌的乙酸和丁酸浓度显著高于对照组和Ⅳ号复合益生菌（P＜0.05），丙酸和总VFA浓度极显著高于对照组（P＜0.01），乙酸/丙酸值极显著低于对照组和Ⅳ复合益生菌（P＜0.01），而Ⅳ号复合益生菌挥发酸浓度虽比对照组高一些但差异不显著（P＞0.05）。各处理组之间比较，Ⅱ号丙酸浓度为52.08 mmol/l显著高于Ⅰ号（P＜0.05），Ⅰ号和Ⅲ号差异不显著（(P＞0.05）；Ⅱ号总挥发性脂肪酸浓度最高，但是处理组间差异不显著（P＞0.05），Ⅱ、Ⅲ号的乙酸/丙酸值显著低于Ⅰ号（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 复合益生菌对瘤胃内环境稳定性的影响

瘤胃pH值是评价瘤胃内环境是否稳定的基本指标,它主要受唾液、饲粮及瘤胃微生物区系的影响。本试验体外培养24 h后各组瘤胃液pH值都较低，这可能是由于本试验的精粗比为6∶4比较高，体外培养试验不能像体内试验那样，将微生物代谢产生的有机酸吸收、排出或中和，再加上，使得产生的酸一直在培养瓶中蓄积，导致pH值较低。但各组pH值与对照组无显著差异，说明添加4种复合益生菌没有破坏瘤胃内环境的稳定性。姜艳美等[7]研究发现添加酿酒酵母菌对人工瘤胃酸碱内环境没有造成不良影响，瘤胃pH值差异不显著,刘彩娟等[8]通过饲养试验表明添加复合益生菌对奶牛瘤胃pH值影响不显著(P＜0.05)这些研究结果与本研究一致，说明使用复合益生菌不影响瘤胃pH值,而且可能对瘤胃内环境具有稳定作用，促进瘤胃微生物在良好的瘤胃环境下生长繁殖。

3.2 复合益生菌对瘤胃发酵功能的影响

本试验发现，添加复合益生菌24 h总产气量与对照组有显著的提高(P＜0.05)，说明添加复合益生菌后，瘤胃微生物生长繁殖旺盛。而且Ⅰ、Ⅱ号复合益生菌微生物蛋白含量极显著高于对照组(P＜0.01)，其中Ⅱ号复合益生菌的微生物蛋白含量最高达270.43 mg/100 ml；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ复合益生菌氨态氮浓度极显著低于对照组(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌干物质降解率极显著高于对照组(P＜0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌的丙酸和总VFA浓度极显著高于对照组(P＜0.01)，乙酸/丙酸值极显著低于对照组(P＜0.01)，Beauchemin 等[9]报道,给育肥牛饲喂粪肠球菌能够提高瘤胃丙酸的浓度。Miller-Webster[10]认为,高浓度的VFA,尤其是高浓度的丙酸可保证牛奶中乳糖含量。Harrison报道,酵母培养基添加于荷斯坦乳牛的日粮中,使瘤胃内乙酸、乙酸与丙酸比例降低。杨朋飞（2009）[11]研究表明：奶牛每天饲喂5 g BLCS微生态制剂可改善奶牛瘤胃发酵功能,显著降低瘤胃内NH3-N浓度,提高菌体蛋白(BCP)、乙酸、丙酸与总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度，这与本研究结果一致，说明瘤胃发酵功能得到了改善。

3.3 复合益生菌组成对瘤胃发酵功能影响及适宜组成

易维学(2010)[12]研究表明粪肠球菌和枯草芽孢杆菌均可较好的抑制大肠杆菌和沙门氏菌的生长；粪肠球菌对嗜酸乳酸杆菌可以起到较好的促生长作用。范利霞（2010）[13]研究表明,乳酸菌、芽孢杆菌产生的有机酸及其代谢产物对一些病原菌有抑制作用,并能激活免疫活性细胞,增强机体免疫力;酵母培养物营养丰富,可促进有益菌的生长、抑制病原菌的繁殖,提高机体免疫能力,并对防治畜禽消化道系统疾病起到有益作用。本课题组研制的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号复合益生菌是以酵母菌、乳酸粪肠球菌、芽孢杆菌复配而成的。本课题组研制的4种复合益生菌对瘤胃内环境具有稳定作用，同时改善了瘤胃发酵功能是与酵母菌、乳酸粪肠球菌、芽孢杆菌等3种微生物特性和功能相符合的。从研究结果来看，以Ⅱ号复合益生菌效果最佳，但最佳添加量有待进一步研究。

4 结论

①添加复合益生菌能够稳定瘤胃内环境，促进瘤胃发酵功能改善。

②以Ⅱ号复合益生菌效果最佳，但最佳添加量和体内效果有待进一步研究。