活禽与饲料源沙门氏菌的分离鉴定及其耐药性对比研究

■张秀芹 杜柏林 韩文瑜

（1.吉林大学农学部动物医学院，吉林长春 130062；2.辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，辽宁沈阳 110016）

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，近些年，由于抗生素在养殖业中大量应用甚至滥用，导致动物源沙门氏菌耐药性不断增加。张秀英等(2007)[1]的报道表明，从三个省分离的禽源沙门氏菌对阿莫西林、磺胺、复方新诺明、链霉素、四环素、萘啶酸及部分氟喹诺酮的耐药率都在50%以上。马孟根[2](2005)报道表明，在四川某猪场分离到的30株沙门氏菌对链霉素的耐药率高达60%。本研究对辽宁省部分地区沙门氏菌进行了分离鉴定，并对其进行了耐药性比较研究，为养殖业临床用药提供了参考依据。

1 材料及方法

1.1 材料

11株沙门氏菌菌株均由本实验室分离获得，质控菌株44113购自中国药品生物制品检定所。

普通营养琼脂、胆硫乳琼脂（DHL）、缓冲蛋白胨水(BPW)和亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)购自北京陆桥生物技术有限公司；科玛嘉沙门氏菌显色培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司，invA基因引物[3]由宝生物工程（大连）有限公司合成；分子生物学反应相关试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

肠杆菌科的生化鉴定试纸条ABI32E购自ABI公司，鉴定血清购自陆桥生物技术有限公司，药敏板购自天津金章科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 采样

活禽样采集：辽宁不同地区4个养殖场，采集泄殖腔拭子，4℃保存。

饲料样品采集：销售环节无菌采样，避免样品人为污染，常温保存。

1.2.2 沙门氏菌的分离鉴定

1.2.2.1 增菌

泄殖腔拭子放入100 ml的SC中，37℃培养24 h；饲料样品25 g放入225 ml BPW中,37℃培养18～24 h,取10 ml培养液加入100 ml SC中，培养24～48 h。

1.2.2.2 分离培养

将SC培养液分别接种于DHL和科玛嘉沙门氏菌显色培养基表面，37℃培养24 h后，挑取DHL上中心黑色边缘透明的菌落及科玛嘉平板上的紫色菌落接种营养琼脂，37℃培养18～24 h进行分离纯化。

1.2.2.3 生化鉴定

用灭菌棉签沾取纯培养物，悬浮于3 ml灭菌生理盐水中，制备成0.5麦氏浓度的菌悬液，使用自动加样器将菌悬液滴入ABI32E试纸条反应杯中，每个反应杯中滴入55 μl，其余操作按试纸条要求完成。37℃培养18～24 h，用ABI细菌鉴定仪判读结果。

1.2.2.4 分子生物学鉴定

将纯化培养物进行DNA抽提，利用invA基因引物[invA-F：TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC，R-：GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT]，按如下程序进行常规PCR扩增：

94℃预变性2 min，30个循环；94℃变性1 min，58.4℃退火40 s，72℃延伸30 s；72℃终延伸7 min后4℃保存。扩增片断为331 bp。

1.2.2.5 分离株的血清型鉴定

将沙门氏菌可疑菌株进行血清型鉴定，按沙门氏菌阳性血清使用说明书作血清型鉴定。

1.2.2.6 分离株的药物敏感性试验

采用微量肉汤稀释（MIC）法，参照美国临床实验室标准化委员会（National Committee for Clini⁃cal Laboratory Stands,NCCLS）推荐的操作步骤，对13种药物进行敏感性试验。将沙门氏菌耐药程度进行比较分析。

2 结果与讨论

2.1 不同来源沙门氏菌的分离鉴定结果

经PCR方法和微生物培养方法共鉴定出11株沙门氏菌。饲料源8株，分别为6株姆班达卡、1株汤卜逊、1株雷根特沙门氏菌；禽源3株，分别为含有O1O4抗原的B群1株、乙型副伤寒沙门氏菌1株和斯坦利维尔沙门氏菌1株。PCR鉴定结果如图1。

图1 沙门氏菌分离株PCR鉴定结果

2.2 不同来源沙门氏菌耐药程度分析(见表1、表2)

表1 沙门氏菌耐药程度分析

表2 肠杆菌科标准菌株（44113）的耐药浓度与敏感浓度（μg/ml）

从表1、2可以看出,饲料源沙门氏菌对10种药物敏感性均高于禽源沙门氏菌,抑菌浓度低于禽源4～128倍不等，且远远低于耐药浓度，仅对临床应用时间较长的磺胺类和多西环素产生耐药。而禽源沙门氏菌同时对10种药物出现耐药，且耐药率达100%，仅对头孢噻呋、黏杆菌素和氧氟沙星较为敏感。

耐药程度与用药情况关系密切。使用的抗菌药物越多，产生的抗药谱越广[4]。养殖环节用药品种多，数量大，时间长，在长期的药物选择压力下，沙门氏菌的耐药情况日益严重。相关研究表明，分离的沙门氏菌株多表现为多重耐药[5-6]。本研究表明，饲料源沙门氏菌对大多数药物敏感，而禽源沙门氏菌却对大部分药物耐药。复方新诺明、磺胺异噁唑等是市场上使用较早的抗菌药物，禽源与饲料源沙门氏菌对上述两种药物易产生耐药性，这说明耐药程度与用药情况存在必然联系。