黑曲霉发酵酱油渣的研究

■李 鹏 马 良 范 寰 王文杰

(天津市畜牧兽医研究所，天津 300112)

酱油渣又称酱渣，是制作酱油后的残渣，其营养丰富，粗蛋白含量约为25%，粗脂肪9.7%、粗纤维13.5%、灰分10.5%[1]，还含有丰富的异黄酮。但其含盐量约7%，鲜渣含水量约70%，因此鲜渣易变质，不宜贮藏[2]，直接用作饲料易造成禽畜食盐中毒、吸收效率低等问题。目前，酱油渣微生物改造主要是利用曲霉和酵母菌以及一些光合细菌提高其蛋白含量[3-4]，而其中粗纤维尤其是木质素的降解研究还未见报道，本试验对黑曲霉的耐盐能力和其对酱油渣发酵饲料化改造进行了研究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger），购于中国农业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试验原料

酱油渣由天津市某酱油厂提供，初水含量为76.35%。

1.1.3 主要仪器或设备

VELP纤维素分析仪、FOSS蛋白测定仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 黑曲霉耐盐性研究

在无菌条件下，用接种针于斜面培养基中取适量菌种，点接到含NaCl浓度分别为0、10、20、30、40、80、120 g/l的 PDA培养基于平皿正中央，于28℃、湿度70%的霉菌培养箱中培养，每个处理5个重复。接种后每隔12 h采用十字法测定黑曲霉菌落直径。

1.2.2 黑曲霉种子培养液的制备

从PDA试管中取10环接种到含有50 ml PDA液体培养基的100 ml三角烧瓶中，摇匀后，置于28℃、湿度为70%的霉菌培养箱中培养24 h，为黑曲霉一级种，再以5%的接种量接种到装有100 ml PDA液体培养基的250 ml三角烧瓶中，29℃、180 r/min条件下培养36 h，为黑曲霉二级种[5]。

1.2.3 黑曲霉发酵酱油渣试验

将黑曲霉二级种接入装有50 g酱油渣的无菌三角烧瓶中，每瓶接入种子液5 ml，28℃、湿度为70%培养。待黑曲霉布满酱油渣时随机取样，而后每隔3 d取1次样，每次取样3个重复，连续发酵30 d。样品121℃、高压灭活30 min后于65℃烘48 h，回潮48 h，测定样品水分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量。以含有5 ml黑曲霉二级种子液的未发酵酱油渣作为对照。

1.2.4 检测指标与方法

干物质采用国标GB/T 6435—2006的方法测定水分含量，计算干物质含量；中性洗涤纤维含量采用GB/T 20806—2006的范氏法；酸性洗涤纤维含量采用农业部NY/T 1459—2007的方法测定；酸性洗涤木质素含量采用国标GB/T 20805—2006的方法测定；粗蛋白含量采用GB/T 6432—94的凯氏定氮法，利用FOSS-2300全自动凯氏定氮分析仪测定。

1.2.5 数据处理

式中：X——各物质成分降解率（%）；

A——发酵前成分总量；

B——发酵后成分总量。

结果采用统计软件DPS7.55进行单因素方差分析和Duncan's新极复差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 NaCl对黑曲霉生长速率的影响

按照1.2.1的试验方法研究，测定黑曲霉的菌落直径，绘制其生长速率，其生长速率随NaCl浓度变化的拟合曲线如图1。

图1 黑曲霉在不同NaCl浓度下的生长速率曲线拟合图

由图1可知，NaCl在0～120 g/l这个区间，黑曲霉的生长速率随NaCl的增加，大致呈三阶多项式形式变化，拟合曲线方程和相互系数分别为：y=0.000 004x3-0.001x2+0.062 2x+0.958 8，R2=0.973。由拟合曲线可知，黑曲霉的生长速率先随NaCl的增加而增加，在40 g/l时达到最大值2.08 cm/d，而后再随NaCl浓度的增加而减小，NaCl浓度在80 g/l以内，黑曲霉生长速率基本不受NaCl浓度的抑制。由于试验用湿酱油渣含有1.87%的NaCl，因此黑曲霉可用于酱油渣的发酵改造。

2.2 发酵时间对黑曲霉发酵酱油渣的影响

按照1.2.4的试验方法检测黑曲霉发酵处理酱渣中各成分含量的变化。通过测定样品中水分、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)，结果见表1，计算干物质(DM)、半纤维素(HC)、纤维素(CEL)和酸性洗涤木质素降解率，绘制降解率随时间变化的曲线如图2。

由表1可知，酱油渣经黑曲霉发酵处理30 d后，粗蛋白含量从27.06%增加到了34.59%，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性木质素、半纤维素和纤维素均有所降低，分别从46.89%、38.4%、14.11%、8.49%、23.94%降低到了36.57%、30.51%、11.46%、6.06%、19.05%。

表1 黑曲霉发酵酱渣各成分含量(%)

图2 黑曲霉发酵酱油渣成分降解率

由图2知，酱油渣接入黑曲霉后，第3 d黑曲霉孢子布满酱油渣，其干物质降解率随时间变化呈三阶多项式形式变化，其线性方程为y=0.002 4x3-0.129 1x2+2.433 9x，R2=0.977 4。半纤维素降解率到第3 d时达到了70.54%，而第3 d到30 d变化不明显，降解率由70.54%增加到84.28%，仅增加了13.74%。纤维素降解率基本上呈线性的形式增加，其线性方程和相关系数为y=0.816 1x，R2=0.974 3，30 d时，降解率为23.86%。由线性方程可知，黑曲霉降解纤维素的能力也较强，尤其是在发酵后期(18～30 d)，其降解率不断增加，超过干物质的降解率。酸性洗涤木质素降解率也呈线性形式变化，其线性方程和相关系数为：y=0.310 5x，R2=0.939 7，由方程可知，黑曲霉降解木质素能力较弱，到30 d时，降解率仅为9.43%。由此可见，黑曲霉能有效降解酱油渣中的半纤维素和纤维素，提高其营养价值。

有研究表明[7]，黑曲霉降解稻草中的木质纤维素具有阶段性，在初级阶段，黑曲霉主要进行纤维素、半纤维素的降解，合成木质素降解酶系；生长稳定后进入次级代谢，分泌酶，开始木质素的代谢，进行木质素的分解；同时各组分均有一定程度上的降解。在本试验中黑曲霉优先降解半纤维素，然后降解纤维素，同时木质素也得到一定程度的降解。

3 结论

NaCl浓度在0～120 g/l以内的PDA培养基上，黑曲霉的生长速率先随NaCl的增加而增加，到40 g/l时达到最大值2.08 cm/d，然后再随NaCl浓度的增加而减小，NaCl浓度在80 g/l以内，黑曲霉生长速率基本不受NaCl的抑制。试验结果表明，黑曲霉适合作为酱油渣的发酵菌株。

黑曲霉能高效降解酱渣中半纤维素，30 d降解率达到了84.28%；同时黑曲霉对纤维素和木质素也有一定程度降解，30 d时对纤维素和木质素降解率分别为23.86%和9.43%。