乳酸乳球菌和魏斯氏菌的分离及鉴定

■商婷婷 张日俊

（中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

抗生素滥用导致药物残留及耐药性菌株的产生，致使人类与动物健康存在隐患。乳酸菌作为食品级的生物防腐剂生产菌株有着无毒、无残留等优点[1]。因此，开发利用乳酸菌及其代谢产物作为新型安全有效的绿色饲料添加剂和天然食品防腐剂成为研究热点。现有研究发现，乳酸菌可产生多种细菌素，如Nisin，对大多数革兰氏阳性菌具有抑菌活性，包括李斯特氏菌、肠球菌、葡萄球菌、链球菌、微球菌、分枝杆菌、棒杆菌和乳杆菌等[2]；此外，乳酸乳球菌(L.lactis)的2个亚种：乳酸亚种(ssp.lactis)和乳脂亚种(ssp.cremoris)在乳酪制作的产香和产黏过程中具有重要的作用，可为凝乳形成和风味产生提供最佳的条件[3]。该研究采用传统方法与分子生物技术相结合，成功分离鉴定了4株乳酸乳球菌和2株魏斯氏菌，旨在为筛选高产且具有高效抑制病原微生物作用的细菌素及改善食品风味的物质的乳酸菌奠定基础，为其在畜牧业与食品工业中的应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

筛选样品：生牛奶（中国农业大学）、自制泡菜水、青贮料（中国农业大学）、市售某品牌奶酪；培养基：MRS培养基、添加0.01%溴甲酚紫的MRS琼脂培养基；试剂：药品均为国产分析纯，细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器（江阴滨江医疗设备有限公司）、涡旋振荡器（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、离心机（上海安亭科学仪器厂）、电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、恒温培养箱（广东省医疗器械厂）、冰箱（Haier）、人工气候箱（广东省医疗器械厂）、电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、WD-9413A凝胶成像分析仪（北京市六一仪器厂）、pH计（美国DEN⁃VER）；YT-IMS-45全自动雪花制冰机（北京亚泰科隆仪器技术有限公司）、电泳仪（北京市六一仪器厂）、温度梯度PCR仪（美国BIO-RAD）、超净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 乳酸菌的分离及菌落形态观察

将样品进行梯度稀释，采用平板涂布法，取100 μl适宜浓度的样品稀释液涂匀于含溴甲酚紫的MRS培养基。将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中，培养36 h，观测并记录菌落形态特征。

1.3.2 乳酸球菌的纯化及细胞形态观察

挑取使添加0.01%溴甲酚紫的MRS培养基变黄的单菌落，采用平板划线分离法，在MRS培养基上反复纯化。挑取生长48 h的单菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检，观察菌体形态颜色是否一致。

1.3.3 乳酸球菌菌种的保藏

挑取长势较好的单菌落，分别接种于MRS斜面培养基和液体培养基，于37℃过夜培养，取出，斜面培养菌种置于4℃冰箱储存，备用。培养液与浓度为60%的甘油等量混合，分装，-20℃保存。

1.3.4 乳酸球菌的生理生化鉴定

通过接触酶试验、甲基红试验、V-P试验、明胶液化试验、吲哚试验、淀粉水解试验等试验对菌株是否属于乳酸球菌进行鉴定；通过糖发酵试验、菌株在4%NaCl、6.5%NaCl下是否生长，菌株在温度为10、40、45℃下是否生长的试验，初步进行了乳酸球菌种间鉴定[4]。

1.3.5 乳酸球菌的16S rDNA序列测定

根据细菌基因组提取试剂盒所示操作步骤，提取目标菌株的基因组DNA。PCR扩增：采用通用引物，正向引物为27f：5'-AGAGTTTGATCCTG⁃GCTCAG-3'，反向引物为1525r：5'-AGAAAGGAG⁃GTGATCCAGCC-3'；反应体系 40 μl：DNA 模板6 μl；上游引物 1 μl；下游引物 1 μl；ddH2O 12 μl；2×Taq PCR MasterMix 20 μl；扩增条件：94 ℃预变性5 min；94℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物的核酸序列由上海英俊公司测定，测序结果与Gen⁃Bank中的已知株序列进行比对，并以ST7为例，利用Clustalx2.0和MEGA5.10构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离及菌落特征

含0.01%溴甲酚紫的MRS培养基由紫色变为黄色，表明有大量酸产生，培养基中为乳酸球菌疑似菌。挑取单菌落，将其纯化，培养36 h，菌落特征如表1。

表1 乳酸球菌在MRS培养基上的菌落形态特征

2.2 乳酸球菌的纯化及镜检细胞特征

镜检下，弃掉杆菌，共得9株乳酸球菌，均为革兰氏阳性，不运动，无芽孢、无鞭毛、无荚膜，球形、卵圆形或一端钝圆、一端较小的类球形，单个、成对或短链。乳酸菌细胞形态特征如图1。

图1 乳酸菌在显微镜下的细胞形态特征

2.3 乳酸球菌的生理生化特征（见表2）

9株菌株在生化试验中，均符合乳酸球菌的鉴别特征，在45℃下均不能生长，可以判定非肠球菌及链球菌[4-5]，其中ST2、ST3、ST4、ST5及ST9不耐4%NaCl，且在40℃下不生长，可以初步判定为乳酸乳球菌乳脂亚种。

表2 乳酸球菌的生理生化特征

2.4 乳酸球菌的16S rDNA序列分析(见表3及图2)

由表3可知，ST1、ST9与乳酸乳球菌的相似性为99%，将其鉴定为乳酸乳球菌；ST2、ST3、ST4及ST5经序列比对为同一菌株，与乳酸乳球菌乳脂亚种的相似性为99%，将其鉴定为乳酸乳球菌乳脂亚种；ST7与乳酸乳球菌乳酸亚种的相似性为100%，将其鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种；ST6与食窦魏斯氏菌的相似性为99%，判定其为食窦魏斯氏菌；ST8与魏斯氏菌的相似性为100%，判定其为魏斯氏菌。

表3 乳酸球菌分离菌株的16S rDNA序列分析

以ST7为例，绘制发育树如图2，更直观地表明ST7为乳酸乳球菌乳酸亚种。

3 讨论

图2 系统发育树

试验中，菌落为乳黄色或暗黄色，而文献中的乳酸菌菌落多为乳白色[3]，丰富了乳酸菌的鉴定依据。在青贮料和市售某品牌奶酪中未筛到乳酸乳球菌，原因可能是试验所用青贮料为焙干的青贮料，在焙干过程中，杀死了乳酸菌；市售奶酪在制作过程中，杀死了乳酸乳球菌。乳酸菌素可以改善肠道微生态平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收[6]，使其在作为饲料添加剂及食品保鲜防腐方面具有巨大潜力。现已发现的乳酸菌细菌素有40余种，但广泛应用的只有乳酸链球菌素（Nisin）[7]。本试验表明，生牛奶是乳酸乳球菌的优良生境，为进一步筛选高产细菌素、类细菌素的菌种奠定了基础，此外，也为选择优良的产黏菌种、提高乳品综合质量提供可能。

Collins MD等提出了魏斯氏菌属（Weissella）的名称[8]，本试验指出，泡菜水是魏斯氏菌的优良生活环境，培养基中添加了溴甲酚紫指示剂，更便于鉴别菌株的产酸能力，筛得的魏斯氏菌产酸速度快、耐酸能力强，可能是泡菜发酵的优势菌种，研究其产酸、产细菌素能力对饲料添加剂行业发展具有重要意义。

传统鉴定方法在筛选及纯化微生物方面具有重要作用，但是对菌株鉴定不够精确，分子生物技术鉴定菌株重现性强、速度快、可靠性高，将二者有机结合，则更好地完成菌种鉴定。

4 结论

通过菌落形态特征观察、镜检细胞形态特征观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列测定及系统发育树的构建，本试验分别于生牛奶和泡菜水中分离鉴定了4株乳酸乳球菌和2株魏斯氏菌，为进一步研究其生物学特性及产细菌素能力奠定基础，为其在饲料工业及食品工业中的应用研究提供依据。