抗菌肽物质与预防小猪下痢

■梁 超

(绿康生化股份有限公司，福建浦城 353400)

抗菌肽是具有抗菌活性的肽类化合物(马卫明，2004)。人类已经对各种来源的1 000多种抗菌肽物质进行了科学研究。有报告指出，我国仔猪全年平均发病率46.5%，死亡率10.3%。仔猪腹泻在养猪业危害中居首位，是影响我国养猪业发展的重要因素之一(邱伟海等，2006)。本文是多篇与小猪下痢有关的抗菌肽物质的研究报告的总结，供相关研究人员参考。

1 乳铁蛋白

1972年Bullen最早发现了乳铁蛋白的抑菌性，且其抑菌性是广谱的，即能同时抑制G-和G+细菌。越来越多的临床研究结果表明，乳铁蛋白可直接或间接地作为抑菌剂或杀菌剂，控制微生物的活性，特别是肠道致病菌。乳铁蛋白被认为是存在于初乳和常乳中宿主防御系统的活性成分。卢蓉蓉等(2008)报道，乳铁蛋白对G-的抑菌效果比G+强。其抑菌作用与铁离子浓度有关，环境pH值变化不影响对G-细菌的抑制作用，但对G+细菌影响较大。乳铁蛋白经过70℃以下的巴氏杀菌后抑菌活性没有影响。早期研究表明，铁离子浓度与仔猪下痢程度呈正比关系(Klasing，2010)。由于乳铁蛋白具有强大的“夺铁”功能，通常认为乳铁蛋白防止仔猪下痢的机理可能与减少铁离子浓度，使造成下痢的病源菌活动降低，从而起到了防止下痢的效果。杨安树等（2006）详细研究了牛乳中乳铁蛋白的纯化和抗菌活性。采用凝胶过滤层析和离子交换法层析分离纯化乳铁蛋白，通过SDS-PAGE和IEF-PAGE鉴定所得样品，同时利用滤纸片法检测样品的抗菌活性，并研究了乳铁蛋白分离纯化过程中抗菌活性的变化。结果表明，离子交换层析纯化乳铁蛋白的效果优于凝胶过滤层析，抗菌活性证实乳铁蛋白样品具有广谱抗菌作用，以蜡状芽孢杆菌为指示菌时，比活为3 077.3 AU/mg(试管法)，纯化倍数提高了20.2倍。黎观红等（2009）研究发现，乳铁蛋白在酸性环境条件下经胃蛋白酶水解后的产物乳铁素具有更强的抑菌活性。且还具有更多的生物活性，如抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗炎症等多种生物学功能。侯振平等（2011）研究乳铁蛋白素(Lfcin)的酶解产物Lfcin B对投喂大肠杆菌断奶仔猪生长及肠道微生物区系影响。结果表明，乳铁蛋白素能降低仔猪腹泻率(P＜0.05)。但仔猪体重及平均日增重均差异不显著(P＞0.05)。由于动物源乳铁蛋白的产量较低，科学工作者一直在尝试用微生物来生产。Liang等(1993)报道了用啤酒酵母中表达重组人乳铁蛋白，其产率为15～20 mg/l。Ward等（1992）用曲霉菌表达重组人乳铁蛋白，以期实现乳铁蛋白的优化生产。近年来，随着“转基因产品”的安全性问题受到关注，商业化生产还暂时难以实现。哺乳动物的初乳中的乳铁蛋白浓度特别高，如人初乳中乳铁蛋白可达6～14 mg/l，是普通人乳中的5倍左右，是普通牛乳中的40～300倍(牛乳中含量为0.02～0.35 mg/ml)。所以，健康的母猪及充足的母猪乳，是仔猪不下痢的可靠保障。如何让初生仔猪获得更多的母猪乳也许是投资最小及效果最好的管理措施。美国FDA曾在20世纪90年代批准了一项法规，在围产期（产前2周和产后2周）的母猪饲料中添加高剂量的亚甲基水杨酸杆菌肽，作为提高母猪肠道健康，从而提高奶牛中乳铁蛋白的质量，能有效提高仔猪健康，在生产中一直得到广泛的应用。

2 猪小肠抗菌肽

肠除了具有消化吸收功能外，它还是重要的内分泌器官，已从小肠中分离到了许多生理活性肽，如 Cecropin P1（Lee 等，1989），PR-39（Ager⁃berth等，1991）、NK-lysin（Andersson等，1995）、乙酸提取物（周洪福等，1995；马卫明，2004）。肠道内容物细菌含量由前向后逐渐增多。小肠上段肠内容物细菌含量很少，大肠内容物细菌含量高达1011个/g。肠道蠕动、消化液、杯状细胞分泌的黏液及肠相关淋巴组织均可抑制肠腔内细菌定植及繁殖，保护肠黏膜。一般认为，肠道黏膜所含有的抗菌肽在调节肠道细菌内容物含量上发挥非常重要的作用。赵燕飞等（2005）用72头36日龄断奶仔猪饲喂不同锌含量及不同种类锌的饲粮的饲养试验。结果显示，58日龄仔猪试验组与对照组相比，高氧化锌组(3 000 mg/kg Zn)显著提高了抗菌肽PR-39基因的表达量，硫酸锌组(100 mg/kg Zn)使抗菌肽PR-39基因的表达也提高了38.4%，但统计结果差异不显著。研究人员认为，高浓度氧化锌有可能对肠膜抗菌肽的产生有促进作用。目前在生产上，主要还是采用肠膜蛋白粉的形式添加到仔猪饲料中，改善仔猪日粮的适口性和消化性及减少下痢现象。肠膜蛋白粉是一种以猪小肠黏膜为原料、经特殊的工艺加工而成的优质多肽蛋白饲料，含50%的肽蛋白，其中低于10个氨基酸残基的小肽含量为38%，具有高吸收率和消化率的产品特性。王春维等（2005）研究了猪肠膜蛋白粉的生产工艺。通过胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对猪肠膜水解效果的研究表明，木瓜蛋白酶优于胰蛋白酶，最佳酶解工艺条件为:水解时间7 h、温度60℃、酶加量2%、pH值6。通过两组不同进出口温度对产品喷雾干燥效果的研究表明，进口温度为180～190℃和190～210℃时，生产出的成品主要指标达到或超过了进口产品。徐军等(2006)选用30日龄断奶仔猪80头，分为4组，以研究不同添加比例的肠膜蛋白粉对断奶仔猪生产性能的影响。试验结果表明，在断奶仔猪日粮中添加肠膜蛋白粉3%～6%效果较好，平均日采食量、平均日增重极显著提高（P＜0.01），证明肠膜蛋白粉是断奶仔猪的一种优良蛋白质饲料。司马博锋等（2011）试验采用单因子试验设计，选用相近胎次和分娩日龄的母猪24头，随机分为4个处理组，各处理组哺乳仔猪从6日龄开始补料，分别饲喂基础料、含肠膜蛋白和血浆蛋白的粉料A组、含膨化豆粕的粉料B组和颗粒料C组，直至21日龄断奶。结果表明，含有肠膜蛋白和血浆蛋白的粉料A组在断奶至断奶后10 d的日增重、采食量均极显著高于其他试验组，饲喂效果最好。使用猪肠膜粉(加工后副产品)作为肠膜抗菌肽来源养猪对防治仔猪下痢有一定的效果。直接使用肠膜粉(抗菌肽)存在资源、产品质量或潜在的生物安全问题。通过基因工程菌生产肠膜抗菌肽仍需研究(马卫明，2004）。

3 杆菌肽

杆菌肽是一种含有12个氨基酸的细菌源抗菌肽，最早于1945年由美国哥伦比亚大学的研究人员从一位名叫Margaret Tracy的7岁小女孩的感染伤口中发现的。杆菌肽具有促进动物生长、提高饲料利用率、抑制动物肠道中有害微生物生长、预防和治疗多种动物肠道疾病的作用，同时具有抗菌谱广、无残留、无休药期、不产生耐药性、无毒副作用、安全性好等特点，在国内外动物养殖和饲料生产中均已有广泛应用(周岩民等，2012)。Smith等(1962)发现，杆菌肽在其最低抑菌浓度下，有与青霉素和环丝氨酸不同的作用机理。杆菌肽对金色葡萄球菌有4种作用机制：①阻碍生长；②引起细胞溶解；③抑制诱导酶的合成；④促进三苯四氮唑氯的减少。而青霉素和环丝氨酸则只有阻碍生长和引起细胞溶解作用，没有抑制诱导酶的合成和无促进三苯四氮唑氯减少的作用。杆菌肽的另一个特性是其活力受锌离子的促进，说明杆菌肽锌与青霉素的抑菌机理不同。Stutz等（1983）发现，杆菌肽在动物肠道中对病原菌魏氏梭菌具有强烈的抑制作用。当杆菌肽浓度为17 mg/kg时，梭菌浓度减少倍数为1 600，而当杆菌肽浓度为57 mg/kg时，梭菌浓度减少倍数为2 666。这项试验数据也许是唯一在动物体内所作的抑制病源梭菌的证据。Nurmi等（1974）发现，杆菌肽不会引起动物肠道中沙门氏菌的大量繁殖，这一特点是杆菌肽在作为饲料中长期添加的物质提供了科学依据。由于杆菌肽也是唯一由“益生菌”所产生的抗菌肽，也是被许多国家所批准零停药期的抗菌肽物质添加剂(农业部168号公告，2001)。

4 硫酸黏菌素

硫酸黏菌素也被称为多黏菌素(colistin)，是一种含有10个氨基酸的细菌源抗菌肽，对诸多革兰氏阴性菌有强烈的抑制作用。硫酸黏菌素最初在日本得到批准作为饲料添加剂，中国在2002年将其批准为二类新兽药和唯一能抑制革兰氏阴性细菌的饲料添加剂(陈绍峰，2003)。Cooperstock(1974)发现，硫酸黏菌素对大肠杆菌内毒素有中和作用。在相同的试验条件下，其它抗菌素，如氯霉素、庆大霉素、链霉素、四环素、氨苄青霉素、羧苄青霉素和磺胺二甲异噁唑等抗菌肽物质都不具备这一特性。大肠杆菌内毒素通常被认为是造成仔猪下痢的主要原因之一。牛志强（2011）在饲料中添加硫酸黏菌素试验，观察体重 30～60 kg左右猪的体重增加、下痢和死亡率。试验发现，当硫酸黏菌素浓度为40～80 mg/kg浓度时，效果最好。王宁（2005）报告，在断奶仔猪饲料中添加60 mg/kg盐霉素和20 mg/kg硫酸黏菌素能显著降低断奶仔猪的腹泻，且能显著地提高生长速度和改善饲料报酬。赵志杰等（2012）报道，当硫酸黏菌素和杆菌肽锌配合使用在断奶仔猪饲料中时，仔猪回肠中的病源性大肠杆菌和魏氏梭菌都受到抑制。而对动物健康有益的乳酸菌和双歧杆菌的生长则有促进作用。各国对微生物源抗菌肽作为饲料添加剂的法规不一样。以中美两国的情况来对比，美国仅批准了两种（杆菌肽和维吉尼霉素）。而中国则批准了5种（杆菌肽、维吉尼霉素、恩拉霉素、那西肽和硫酸黏菌素）。各种微生物源抗菌肽作饲料添加剂性能和特征的比较见表1。

表1 细菌源抗菌肽的比较

5 溶菌酶

溶菌酶是一种含有129个氨基酸单位的抗菌物质，由于它的作用机理为水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁质肽聚糖，因此被称为“溶菌酶”。它的最初发现也是由青霉素的发明人英国细菌学家Fleming先生在1922年，由人鼻黏液中发现的，并取名为溶菌酶。后来，Abrallan等于1937年在鸡蛋清中也分离出溶菌酶物质（朱伶俐，2012）。邵春荣等（1996）按每吨仔猪诱食料和开食料中加入15 g溶菌酶制剂，饲喂至60日龄。试验组平均日增重比对照组提高4.96%，仔猪腹泻率降低了22%。该结果表明，溶菌酶能提高动物机体的防御能力，有效地减少仔猪腹泻。邱伟海等(2006)进行了在28日龄断奶仔猪日粮中添加溶菌酶的试验。结果表明，溶菌酶添加量为300 g/t和500 g/t的小猪腹泻率分别为15%和5%，而空白对照组小猪的腹泻率为65%。张锋(2006)研究溶菌酶在防治仔猪大肠杆菌下痢的结果表明，溶菌酶较传统药物的对照组具有以下优点：①效果明显：在预防方面，中、高剂量溶菌酶组较药物对照组腹泻率分别下降 86.37%和 93.06%，差异极显著（P＜0.01）。溶菌酶组治愈率达到93%以上。②疗效快：溶菌酶组平均治疗次数为2.03次，较药物对照组差异极显著（P＜0.01）。③促生长效果明显：中、高剂量溶菌酶组日增重比药物对照组分别提高5.41%和5.65%，与药物和空白对照组相比差异极显著（P＜0.01），料肉比分别降低7.56%和6.40%，与药物对照组相比差异显著（P＜0.05）。朱军英等(2009)用溶菌酶饲喂怀孕母猪来研究预防仔猪腹泻及对仔猪增重的影响。在60日龄前试验组仔猪腹泻率为20.95%，对照组仔猪腹泻率41.67%，试验组比对照组腹泻率极显著降低了49.6%（P＜0.01）。仔猪在25日龄时试验组平均日增重为222.8 g，对照组平均日增重为221 g，差异不显著（P＞0.05）；仔猪在60日龄时试验组平均日增重为299 g，对照组平均日增重290 g，差异不显著（P＞0.05）。另外，朱军英等用溶菌酶饲喂仔猪来研究预防仔猪腹泻的效果，结果表明仔猪在60日龄时，添加溶菌酶的各组平均日增重分别为 303、327、290、241 g，比空白组日增重提高35.7%，差异极显著（P＜0.01）。在60日龄期间，添加溶菌酶的各组腹泻率分别为25.5%、10.2%、41.7%和 68.9%，比空白组腹泻率分别降低了63.0%～85.2%，差异极显著(P＜0.01)。付琴等(2012)报告了溶菌酶有可能是引起人体过敏的原因之一。但溶菌酶是否会引起幼年动物过敏还不清楚。另外，在饲料工业中的产品一般是转基因溶菌酶产品，这是否存在风险也是需要注意的问题。

6 天蚕素

天蚕素是最早被发现的动物源抗菌肽，目前已从各种生物中发现了90多种。第一个天蚕类素是瑞典科学家Boman等(1972)首次用大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)，从其血淋巴中分离得到天蚕素抗菌肽。Boman等又进一步测定了天蚕素抗菌肽A和B的一级结构，随后天蚕素抗菌肽相继被分离、纯化，并且其氨基酸的结构特征和基因序列得到确定。到目前为止，天蚕素抗菌肽共有A、B、C、D、E 5种结构，另外还发现多种类似物。天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最明显的抗菌肽（杜淑环，2012)。温刘发等(2001)将活性为4 000单位/g的天蚕素，按160、320 g/t和480 g/t添加到断奶仔猪饲料中，饲养两周后观察仔猪腹泻情况。结果表明，含药物饲料组，低剂量天蚕素组(160 g天蚕素/t)和中剂量天蚕素组(320 g天蚕素/t)，基本都没有下痢现象。但在未加药物饲料组和高剂量天蚕素组(480 g天蚕素/t)都有明显的下痢。实验者认为抗菌肽制剂的添加量对不同生长阶段仔猪的抗腹泻能力存在着差异。因此抗菌肽制剂使用的剂量要适当。抗菌肽制剂对不同周龄、不同品种断奶仔猪的适宜添加剂量尚有待于进一步研究。黄亚东等(2002)采用PCR技术改造抗菌肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα-A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母(Pichia pastoris)受体菌GS115中。采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经α-Factor信号肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。戴求仲(2012)在断奶仔猪上的试验用天蚕素产品(肽生素)取代吉他霉素和喹乙醇，试验组药物配方为160 g/t肽生素(天蚕素)+54 g/t硫酸抗敌素，作为对照组的药物配方为140 g/t吉他霉素+60 g/t喹乙醇(50%)+540 g/t硫酸抗敌素(10%)。试验44 d后的结果表明，试验组的末重和平均日增重比对照组分别高出0.71 kg和16.14 g/d，提高幅度为3.01%(P＞0.05)和4.94%(P＞0.05)。试验组采食量、料肉比和腹泻率均低于对照组，其中料肉比较对照组降低了5.13%，差异显著 (P＜0.05)，而腹泻率降低了18.66%(P＞0.05)。李永新(2009)在产仔前35 d母猪饲料中添加天蚕素抗菌肽饲料添加剂(0.3%)，观察母猪产仔及仔猪健康状况。结果表明:试验组母猪的窝均产仔数和窝均活仔重量均高于对照组;分娩、断奶的成活率分别比对照组提高了6.48、16.10个百分点;弱仔率由11.49%下降到3.40%，仔猪腹泻率由7.45%下降到3.53%。王阿荣(2011)将不同水平的天蚕素添加到断奶仔猪日粮中，研究天蚕素对断奶仔猪生长性能、血液生化指标和营养物质表观消化率的影响。结果表明：适量的天蚕素抗菌肽能提高断奶仔猪平均日增重，但各处理组间差异不显著(P＞0.05)；与对照组相比，试验组能显著降低料肉比(P＜0.05)，显著降低腹泻率(P＜0.05)。在本试验条件下，天蚕素抗菌肽添加量为320 g/t时的效果最好。温刘发等(2011)用转基因抗菌肽制剂做防止仔猪下痢试验，发现抗菌肽的有效剂量为0.5 ml/kg饲料，安全剂量为3 ml/kg饲料。连续饲喂28 d，具有预防仔猪腹泻，提高存活率，增加体重，降低料肉比的效果。在仔猪体内，包括肝、血、肉及粪便均未发现抗菌肽基因残留，亦未检出活性转基因酵母在猪舍的土壤、水体、垃圾及废弃物中存在。认为抗菌肽的长期(280 d)毒理试验及“三致”试验，属无毒性的安全的产品，说明该抗菌肽制剂是安全的。2004年，农业部转基因生物安全办公室批准其在仔猪中应用，批准文号为农基农证[字(2004)第29号]。

7 总结

各种抗菌肽物质，如乳铁蛋白、溶菌酶、天蚕素、肠膜抗菌肽、杆菌肽和硫酸黏菌素等，都是生物进化过程中所形成的“固有免疫物质”(Pasupule⁃ti，2009)。试验和实践证明，，它们在预防仔猪下痢方面大有可为。然而，到目前为止，除了细菌源抗菌肽产品的使用比较成熟之外，其它来源的抗菌肽产品还存在一定的技术性和法规性问题（韩文瑜等，2009）。为了研发出绿色、新型、高效、低毒、广谱的抗菌肽产品且将它们推向市场还面临很多挑战。对于细菌源抗菌肽产品来说，它们也许要通过更多的研究和创新，使它们能对畜牧业做出更大的贡献。

（参考文献44篇，刊略，需者可函索）