高密度脂蛋白对腹腔感染败血症小鼠保护作用的实验研究

贾宝辉，韩飚，陈军喜，刘艳，高新愿

(南昌大学第四附属医院重症医学科，南昌 330003)

细菌等病原体侵入机体后，通过某些特定的途径触发全身性炎性反应。感染性休克或败血症本质上就是一种失控的自我破坏性的全身性炎性反应过程。败血症是感染引起的全身性炎性反应，而感染性休克则是败血症的某个严重形式或严重阶段[1]。高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)广泛参与炎症反应环节，具有抗氧化、抗炎、增强内皮功能、抗血栓形成等作用。体外实验证实HDL能减少脂多糖 (LPS)诱导的细胞因子产生，HDL对LPS诱导的脓毒症动物模型有保护作用，其机理与中和LPS有关[2]。败血症／感染性休克的主要病理生理基础在于全身性炎性反应综合征。HDL对败血症／感染性休克的作用如何，目前尚不清楚。本研究采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法复制败血症小鼠模型，观察HDL对小鼠总体生存率、重要脏器组织病理学变化及血浆促炎性细胞因子水平的影响，探讨HDL对败血症的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康昆明小鼠，雌性，体重20-25g(武汉大学医学院实验动物中心提供)。60只小鼠随机分为对照组(假手术组)、CLP组和HDL组共3组，每组20只，用于观察生存率和记录平均生存时间。另取36只小鼠随机分为对照组、CLP组和HDL组，每组12只，用于观察12h肝、肺组织病理学变化和测定2h血浆肿瘤坏死因子水平。模型制备成功后立即尾静脉注射HDL，以后每间隔8h追加注入，直至模型制备成功后48h。

1.2 小鼠败血症模型制备 参考文献[3]方法建立败血症／感染性休克小鼠模型。动物术前禁食12h,腹腔注射质量分数为7%的水合氯醛350 mg/kg麻醉。于左下腹作长约1-1.5 cm切口，游离肠系膜和盲肠，4号丝线在距盲肠盲端2/3长度处环行结扎,12号针在距盲端1cm处贯通穿刺，挤出粪便少许，将肠系膜和盲肠回纳入腹腔。逐层缝合关腹。术后立即皮下注射生理盐水3ml/100g，以补充术中液体丢失;同时每只小鼠肌注青霉素2×104U以预防切口感染。术后小鼠自由进食饮水。对照组仅做开腹、盲肠游离及关腹术，其余同CLP组。

1.3 一般状况和生存率 观察动物有无萎靡、寒颤、竖毛、腹泻、脓性尿及眼角分泌物增加，及其呼吸，大小便，饮食和活动情况。共计观察7d结束。记录3组动物48h内总体生存率和平均生存时间。

1.4 病理学检查 CLP后20h取肝、肺、肠组织经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片,HE染色后在普通光学显微镜下观察病理改变。另取适量肝、肺组织4℃下以2.5%戊二醛溶液固定24h，再以1%锇酸固定1.5h，脱水包埋制备透射电镜切片，在H-600型透射电镜(Hitachi公司,日本)下观察组织超微结构变化。

1.5 血浆促炎性细胞因子浓度测定 分别于模型制备成功后2h处死动物取血，离心后获取血浆。采用酶联免疫吸附法测定血浆肿瘤坏死因子-α(tmor necrosis factor-alpha，TNF-α)的浓度。 试剂盒购自武汉博士德生物公司。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。使用CurveExpert 1.3软件绘制标准曲线并计算出待测样品浓度值，以pg/ml表示。每个待测样品及标准品均作双复孔。

1.6 统计学处理 应用SPSS 11.5统计学软件进行分析。采用生存分析法(survival analysis)进行组间比较，并绘制各组生存率曲线。多组间比较采用单因素方差分析，多组的两两间比较采用SNK检验。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 一般状况及大体观 与对照组相比，CLP小鼠麻醉苏醒延迟，活动减少，嗜睡，精神萎靡，食欲减退，体重减轻，腹泻、脓尿、眼角分泌物增多。濒死前部分出现皮下出血、鼻腔内血性分泌物渗出、寒颤、呼吸窘迫，四肢肌张力增高甚或颈项强直。解剖可见CLP小鼠腹腔混浊脓性渗出液较多，伴恶臭；盲肠肿胀、坏疽和粘连；空肠肠管胀气；肺脏体积增大,色暗红,表面可见出血斑点。肝脏和其余脏器肉眼观察未见明显异常改变。HDL组小鼠一般状况及大体形态学改变均较CLP组明显减轻。

2.2 总体生存率和平均生存时间 术后24、36、48h总体生存率分别为：对照组100%、100%、100%;CLP组 40.0%、25.0%、20.0%;HDL组 80.0%、63.3%、56.7%。动物平均生存时间为：对照组7d，CLP组18h，HDL组6d。与CLP组相比，HDL组生存率明显提高(P<0.01)。

2.3 病理学变化 肝组织 光镜下可见CLP组肝细胞肿胀、空泡样脂肪变性，点状或小片状坏死。肝脏门管区局灶性脓肿，肝血窦扩张，中性粒细胞浸润于血管壁。HDL组肝细胞浊肿，轻度脂肪变性，未见明显坏死灶。肝血窦中中性粒细胞浸润较轻，电镜下对照组肝细胞核膜清晰，线粒体、溶酶体结构正常，内质网分布于核周，糖原丰富。CLP组肝细胞胞浆内可见较多脂肪滴，溶酶体增多，线粒体水肿，滑面内质网扩张，肝细胞内大量异染色质边集凝聚成块，核固缩。HDL组细胞核中仅有少量异染色质，线粒体轻度水肿，脂肪滴可见，滑面内质网轻度扩张。

肺组织光镜下CLP组肺泡及肺间质内毛细血管充血,中性粒细胞浸润，微血栓形成。肺间质水肿，肺泡隔疏松增宽,炎性细胞浸润明显。HDL组小血管及毛细血管内中性粒细胞浸润较轻，肺间质轻度水肿，肺泡隔增宽不明显。电镜下CLP组肺泡毛细血管腔内可见中性粒细胞集聚，部分血管内皮细胞肿胀，线粒体肿胀空泡化，轻度板层小体排空。与CLP组相比，HDL组变化不明显。

2.4 血浆TNF-α浓度的变化 与CLP组 (213.40±20.17)比较，术后 4hHDL组 TNF-α 浓度(185.07±8.28)明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。

3 讨论

内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜的组成成分，是引起败血症/感染性休克的重要致病因子之一。内毒素与存在于单核/巨噬细胞膜上的相应受体相互作用后，通过一系列细胞内信号转导机制促进肿瘤坏死因子、白细胞介素等促炎性细胞因子在体内大量表达，导致机体产生全身性过度炎性反应，这是败血症/感染性休克的主要病理生理机制。

本研究结果显示，鼠遭受CLP术后，血浆中TNFα显著升高，与肝组织炎症病理改变明显相关。而应用HDL后，血浆中TNFα含量显著降低，肝组织炎性病理改变明显减轻，表明HDL可减轻全身性炎性反应，并具有保护肝功能的作用。其机制可能是抑制机体释放TNFα，从而拮抗肝脏组织乃至全身性的炎性反应。

TNF是炎症反应早期阶段的介质，是外源物质入侵引起的炎症反应中的基本表现。TNF可激活其他细胞释放细胞因子如白介素 1(IL-1)、高迁移率物质B1(HMGB1)和炎症介质如类花生酸、一氧化氮、活性氧族,这些物质能引起进一步的炎症反应和组织损伤。TNF可扩大并延长炎症反应,降低TNF活性可限制炎症反应。

高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)广泛参与炎症反应环节，具有抗氧化、抗炎、增强内皮功能、抗血栓形成等作用。HDL的蛋白成分复杂，功能与其脂质、载脂蛋白、酶以及脂质转运蛋白的数量与质量有关。HDL载脂蛋白部分主要是载脂蛋白AI及载脂蛋白A II(apoA I，apoA II)。体外实验证实HDL能减少脂多糖(LPS)诱导的细胞因子产生，HDL对LPS诱导的脓毒症动物模型有保护作用，其机理与中和LPS有关[4,5]。临床研究亦证实低HDL水平的重症患者预后差[6]。HDL对炎症细胞及炎症过程的作用广泛。HDL抑制NF-κB合成、抑制黏附分子1、IL-1、E选择素等表达，减少内皮细胞、中性粒细胞的黏附。已知NF-κB的激活以及其它炎症因子如IL-1、IL-6都能导致中性粒细胞、单核细胞、树突状细胞等TNF-α产生增加。

本研究证实高密度脂蛋白抗炎作用的受体机制和受体后作用靶点，为感染性休克肺损伤的治疗开辟了新的研究方向，并为开发高密度脂蛋白新的治疗用途提供理论帮助。

[1]Surviving sepsis campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2008[C].Crit Care Med,2008,36(1):296.

[2]Murphy AJ,Chin-Dusting JP,Sviridov D,et al.The anti inflammatory effects of high density lipoproteins[J].Curr Med Chem,2009,16(6):667.

[3]金惠铭.盲肠结扎穿刺后的大鼠败血症模型[J].中国病理生理杂志,1990,6(2):126.

[4]Robbesyn F,Garcia V,Auge N,et al.HDL counterbalance the proinflammatory effect of oxidized LDL by inhibiting intracellular reactive oxygen species rise,proteasome activation,and subsequent NF-kappaB activation in smooth muscle cells[J].FASEB J,2003,17(6):743.

[5]Thaveeratitham P,Khovidhunkit W,Patumraj S.High-density lipoproteins (HDL)inhibit endotoxin-induced leukocyte adhesion on endothelial cells in rats:effect of the acute-phase HDL[J].Clin Hemorheol Microcirc,2007,36(1):1.

[6]Murphy AJ,Chin-Dusting JP,Sviridov D,et al.The anti inflammatory effects of high density lipoproteins[J].Curr Med Chem,2009,16(6):667.