猪乳头数性状QTL研究进展

许儒祥，卫 宁，杨公社，庞卫军

(西北农林科技大学 动物科技学院, 陕西 杨凌 712100)

猪乳头数性状属中等遗传力(h2)性状(0.22< h2<0.41)，其数目与产仔数有较强的相关性。因此，在种猪育种实践中，乳头数作为重要繁殖性状的指标。种公猪对仔猪乳头数性状h2有重要影响，故种猪选育不仅要重视种母猪乳头数性状的选择，也要考虑种公猪乳头数性状的选择。目前，乳头数性状的主要研究方法是首先根据美国USDA-MARC 的猪遗传连锁图谱初选乳头数性状微卫星标记，对构建的与乳头数性状相关的资源群体进行全基因组扫描，从而获得QTL初步定位结果；其次，在初步定位区域的基础上选择和开发微卫星、SNP遗传标记，在资源家系群体中进行基因分型以开展精细定位；最后，进一步对精确定位区域进行高密度SNP搜寻和鉴定，并使用飞行时间质谱技术对这些SNP位点进行基因型判定，并通过SHEsis软件的x2进行与乳头数性状关联性分析。本文综述了猪乳头的形成和调控机制，乳头数性状QTL定位方法及其研究进展，旨在为种猪乳头数性状选育提供参考。

1 乳腺与乳头的发育

乳头作为乳腺的附属物，与乳腺形态发生密切相关。在胚胎期猪乳腺的形成与发育主要包括乳线(Milk line)的形成与特化、乳腺基板(Placode)的形成、腺芽(Bud)的形成和原始乳腺导管分支(Primary sprout)的形成四个阶段[1-2]。每个阶段都由多种基因和不同的信号通路共同调控。如Fgf10和Fgfr2b基因在胚胎早期开始表达，并对乳线特化和乳芽形态形成有重要的作用[1,3]；Wnt受体基因 (TOP-GAL)于胚胎发育第10天在外胚层和间质细胞中开始表达，通过Wnt信号通路对乳线的形成和特化进行调节[1,3-5]。此外，一些激素如孕酮、催乳素、甲状腺素、雄激素和雌激素等对乳头的形成也有重要调节作用[6-7]。

1.1 调控胚胎期乳腺和乳头发育的信号通路

信号通路途径之间的相互作用不仅能调控乳腺和乳头的形态发生，而且可调控乳腺和乳头形态发生的位置[8]。影响胚胎期乳腺和乳头形态发生的信号通路途径主要有Wnt信号通路、Fgf信号通路、Tbx3通路、Egf家族通路和IGF-1/P190-B通路等。

1.1.1 Wnt信号通路 在乳腺和乳头形态发生过程中占重要地位，能够调节乳线特化和乳基板形成[9-10]。Wnt信号通路主要包含经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路。在经典Wnt信号通路中， Wnt10b基因表达于胚胎早期，是外胚层乳线的内源标志基因，调控乳线特化和促进第1、2和5对乳芽的形成[1,3-5]；在非经典Wnt信号通路中，Wnt5a和Wnt11基因也表达于胚胎早期，但Wnt5a-/-敲除鼠乳腺发育正常，不是乳腺形态发生所必须，可能在与经典Wnt信号通路对抗中共同调控乳腺形态发生[10]。

1.1.2 Fgf信号通路 在小鼠胚胎10.25 d，Fgf10和Fgfr2表达于胚胎胸体节中部和腹侧顶部，并决定着外胚层和乳线发育命运，是乳腺早期发育所必须；Fgf10和Fgfr2b基因能够调节乳基板的发育，当Fgf10和Fgfr2b被敲除时，小鼠只能形成第4对乳基板[3,11]。

1.1.3 Tbx3通路 Tbx3是一种转录因子，小鼠胚胎10.25 d在乳腺基质中开始表达，能通过与Wnt10b、Lef-1和 Fgf10等基因相互作用共同调节乳基板的形成发育；Tbx3+/-小鼠表型能形成正常的乳基板，但胚胎胸节处3个乳芽不能正常发育和维持；Tbx3-/-小鼠比Tbx3+/-小鼠有更严重的表型，其大部份乳基板不能成功发育[12-13]。

1.1.4 Egf家族通路 Nrg基因属于Egf家族成员之一，能将胚胎脊柱轴下方细胞的Fgf10表达信号传递至乳腺间质，调节乳腺基板的发育；另外，Nrg基因能加强和促进乳间质和上皮细胞中经典Wnt信号通路表达，对乳腺基板发育进行调控[14]。

1.1.5 IGF-1/P190-B通路 小鼠胚胎12.5 d，P190-B在乳芽上皮细胞及周围间质中开始表达，其敲除鼠乳芽较小并且乳间质紊乱不能表达AR基因，此外，P190-B能够与IGF-1相互作用，共同调控乳芽的成熟[15]。

1.2 基因对胚胎期乳腺和乳头发育的调控

在猪乳腺和乳头形态发生过程中的不同阶段，除受主要信号通路调控外，还存在一些其他基因的调控：PTHrP 和PTHR1基因表达于胚胎早期对乳腺形态发生过程有重要作用，当PTHrP 和PTHR1基因被敲除时，小鼠乳腺导管和乳头的形态发生消失[16-17]；GATA-3表达于胚胎早期，通过调控乳腺腔上皮细胞命运从而影响乳腺的正常发育[18-19]；BMP4是骨成型蛋白家族成员之一，不仅可通过调节下游LEF-1基因经由Wnt信号通路对乳腺形态发生进行调控，而且也可通过与Tbx3相互抑制作用经由Tbx3信号通路调控乳腺的形态发生[20]；Msx2表达于胚胎时期乳芽上皮细胞，其敲除鼠表现乳芽发育正常，但乳芽副产物及乳头形态发生受到影响[16,21]。

2 猪乳头数性状QTL定位及候选基因

2.1 猪乳头数性状QTL定位方法

猪乳头数性状QTL定位方法主要包括资源群体组建、初步定位和精确定位、高密度的SNP搜寻以及候选基因的筛选等。

2.1.1 资源群体 主要包括家系群体和远源群体两种。家系群体一般选取对目的性状差异较大的两个纯种群体作为F0代，通过F0代杂交得到F1代，然后在F1代中选取乳房、生殖器管和骨骼符合选育标准的优秀个体再进行自交，得到拥有性状分离的F2代，F0、F1和F2代就组成了所要构建家系群体。Ren等[22]利用耳面积差异很大的白杜洛克公猪与二花脸猪母猪进行杂交构建家系群体，并通过F0、F1和F2代成功地定位了影响耳面积的QTL区域。远源群体则是由各地方品种以及外来猪种组成的群体。对远源群体的利用主要是通过其间差异来对比分析QTL区域，使定位更加精准。

2.1.2 初步定位和精确定位 对乳头数性状来说，可根据美国USDA-MARC猪遗传连锁图谱选取微卫星标记，对已建好的资源群体三代个体进行全基因组扫描分析，初步确定定位区域。然后在此区域选择已知的微卫星标记或开发一些新的SNP遗传标记进行精确定位，最终得到较精确的影响猪乳头数的QTL[22-23]。

2.1.3 高密度的SNP 根据SNP具有密度高、多态性丰富、遗传稳定性高和可自动化分析等特点，对上述已经精细定位的影响乳头数性状的区域进行高密度SNP搜寻和鉴别，精细作图绘制高密度遗传图谱。同时，根据飞行时间质谱技术对品种间或品种内个体中已选定的SNP进行基因型判定，并通过SHEsis软件的x2进行与乳头数性状关联性分析[23]，从而有利于更好的研究候选基因。

2.1.4 候选基因的筛选 候选基因的概念在不同的研究领域中有所不同，生理学家认为所有假定涉及特定性状表达的基因均为候选基因。在以上的精准定位后，通过精细作图绘制遗传图谱可能把这些候选位点的数量减少到几百个。然后通过基因表达谱对假定基因进行选择，找出对与目的性状相关的基因，选出合适的候选基因[22-23]。

2.2 猪乳头数性状QTL定位及候选基因

猪乳头数性状QTL定位的研究主要包括总乳头数性状QTL定位和左右侧乳头数性状QTL定位两方面。

2.2.1 总乳头数性状QTL定位 目前国际上已有多个利用不同资源群体定位猪乳头数性状QTL的报道，在除SSC18外的所有常染色体成功定位到影响乳头数性状的QTL[24-26]。在乳头数性状QTL定位的研究中，大部分是以梅山猪和其它的品种猪构建的样本家系。Bidanel等[27]利用梅山×大白F2资源群体将乳头数性状QTL定位于SSC3、SSC4、SSC7、SSC8、SSC11、SSC16；Zhang等[28]利用梅山×大白F2资源将乳头数性状QTL定位于SSC6和SSC7；Wada等[29]利用梅山×阿根廷小型猪F2资源群体将乳头数性状QTL定位于SSC1和SSC7；Sato等[30]利用梅山×杜洛克F2资源将乳头数性状QTL定位于SSC3、SSC7、SSC8和SSC12。而小部分则是利用除梅山猪以外的其它猪种作为亲本构建家系。Ding等[31]利用白杜洛克×二花脸F2资源群体将乳头数性状QTL定位于SSC1、SSC3、SSC4、SSC5、SSC6、SSC7、SSC8、SSC9、SSC12、SSC13、SSC14和SSC16。因此，不同的种群猪乳头数在染色体的QTL定位不同，这说明猪乳头性状调控的复杂性。在我国相关领域研究中缺乏本地猪种之间建立的杂交系，从选种的角度，应加大选种力度，充分利用地方品质资源。

2.2.2 左右乳头数性状QTL定位 在母猪乳头相关性状中，除了乳头总数之外，还有一个重要的组分性状，即左右乳头数目不对称。其原因可能是由于在胚胎发育过程中异常而导致。另外，猪乳头的左右对称情况与胚胎期乳头原基发育相关，因此推测母猪乳头的左右对称性可能与其泌乳性能有关。据报道，在白色杜洛克×二花脸F2资源群体中左侧乳头数性状QTL定位位于SSC1(142cM)、SSC3(119/46cM)、SSC4(40cM)、SSC5(74cM)、SSC6(125cM)、SSC7(95/59cM)、SSC8(80cM)和SSC12(79cM)，右侧乳头数性状QTL定位位于SSC1(134cM)、SSC3(56cM)、SSC4(23cM)、SSC5(77cM)、SSC7(93/60cM)和SSC12(58cM)[31]。猪左侧和右侧乳头数性状QTL在染色体上的定位有较大的差异，具体受哪些基因的调控还有待研究。

2.2.3 猪乳头数候选基因 Wimmers等[32]研究发现，位于SSClq28-29的RLN(relaxin gene，RLN)与翻乳头的形成相关；ESR(estrogen receptor，ESR)位于SSC1p24-25，属于核受体超家族成员之一，是由配体活化的转录因子，与猪乳头形成有关[33]；位于SSC2的IGF-2和FSH (follicle- stimulating hormone，FSH)是影响乳头形成的位置候选基因[33-34]，其β基因能够对种猪乳头数及产仔数产生直接的影响；位于SSC5上的IGF-1和PTHLH(parathyroid-hormone-like hormone，PTHLH)能与不同的通路共同调节乳腺和乳头的形态发生；位于 SSC6上的TGFB和 LEPR (leptin receptor，LEPR)基因是影响乳头形成的候选基因[35]；位于SSC7上的PRL(prolactin gene，PRL)对乳头的特征有重要的影响[36]。

PTHLH和PTHR-1(parathyroid hormone-like hormone receptor 1，PTHR-1)对乳头上皮间质细胞间相互作用进行调控，影响乳腺、乳头的形态发生。在杜洛克与柏林小型猪构建的F2群体中进行猪乳头数性状QTL搜寻，结果表明PTHLH和PTHR-1是影响总乳头数和倒乳头数的候选基因，同时也发现 FGFR2、GHR、HGF、PDGFA、PDGFRA、PDGFB和VEGF等7个基因在正常和翻乳头之间表达差异显著[35-36]。对PTHLH和PTHR1基因进行进一步分析发现，在杜洛克和柏林小型猪中PTHR1的SNP位点C1819T与总乳头数和倒乳头数显著性相关；PTHLH的SNP位点C375T与倒乳头显著相关，但在柏林小型猪中没有发现与总乳头数和倒乳头数的相关性。

LEF-I(lymphoid enhaneer-binding factor-l，LEF-I)基因属于TGF家族成员之一，能直接耙定β-连环蛋白调控Wnt信号通路，是经典Wnt信号通路关键调节因子。LEF-1基因位于猪第八染色体，含有12个外显子，在早期胚胎中开始表达，是调控乳腺和乳头形态发生的重要基因。Jonas等[35]通过对LEF-I mRNA进行SNP搜寻，发现在lEF-1 mRNA 3′端存在2个SNP 位点(NM_001129967.1: g. 1351T>C和NM_001129967.1:g. 1666A>C)，其中SNP位点1351T>C与倒乳头数和总乳头数显著相关，SNP位点1666A>C与商品猪倒乳头数显著相关。

乳头数是种猪繁殖性能选育的重要指标之一，与窝产仔数和母猪的哺育率有较强的相关性。但到目前为止，影响乳头数的主效基因还没有筛选出来，仍需进一步探索。国内外研究利用不同品种间和品种内进行QTL定位并寻找影响猪乳头数性状的主效基因，但结果并不理想。另外，定位的结果也存在着差异性，不仅表现在QTL数目、定位的染色体区域，而且即使相同QTL定位的效应也不完全相同[37]。其原因可能是由于采用的分子标记数目和密度不同以及乳头数性状的遗传基础不一样所致。因此，今后应适当的增加分子标记密度，运用更为精准的高密度SNP标记方法挖掘我国地方品种和培育品种乳头数性状的候选基因，进而通过与性状关联分析确定主效基因，为选育具有较多乳头数的种猪提供理论依据。

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