泡菜中乳杆菌的快速检出和乳杆菌质粒资源的初步调查

杨四佳， 王 颖， 李宇婷， 李 晨， 张 进， 刘 锐， 潘 渠

（1.成都医学院 基础医学院，四川 成都 610083；2.成都医学院 检验医学院，四川 成都 610083）

质粒是染色体外可自我复制的遗传元件，在各类生物细胞中均有发现，对分子生物学的发展和基本生命现象的认识一直发挥着不可替代的作用。乳杆菌的质粒不仅决定了乳杆菌的某些性状，还应用于乳杆菌克隆表达载体的构建，是一种珍贵的遗传信息资源。

自从1976年Chassy首次在乳杆菌中发现质粒以来，已经有数十个乳杆菌质粒被发现。近年来，传统发酵食品中的乳杆菌质粒资源被不断的发掘。希腊传统奶酪Kopanisti中分离到了pLAC1质粒和属于theta复制pUCL287家族的pREN质粒。通过序列分析，在pREN质粒上发现了新的复制起始蛋白，并首次分析了pUCL287质粒家族复制起始位点的保守程度[1]。中国内蒙的马奶酒中分离到了属于滚环复制pMV158家族的pTXW质粒。该质粒编码了一个移动蛋白（MOB）家族的释放酶，并且具有较高的拷贝数，是构建载体的良好材料[2]。

中国泡菜历史悠久，源远流长。在四川和重庆，基本上家家户户都有一个泡菜坛子。已经从中国泡菜中分离了十几种乳杆菌[3]。却很少有人关注中国泡菜中的乳杆菌质粒。到目前为止，只报道了两个质粒。两个都是从四川泡菜中分离的植物乳杆菌质粒。一个是质粒pLR1，属于滚环复制pC194家族，有36个拷贝数[4]；另一个是我们分离鉴定的质粒pLP18，属于滚环复制pMV158家族，每个菌体有24个拷贝[5]。

为了探明中国泡菜中乳杆菌和乳杆菌质粒资源，作者开发了快速的乳杆菌检出方法，并对52份泡菜样品进行了检测。检测结果表明，中国泡菜中存在丰富的乳杆菌质粒资源，值得进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

采集泡菜样品52份，主要采自四川，有4份样品分别采自辽宁、青海和山西，见表1。乳杆菌菌株均用 MRS培养基[6]，在 37℃静置培养 18～48 h，其它菌株使用LB培养基，在37℃培养18 h。PCR（Ex Taq）和T载体试剂盒购自大连宝生物公司（TaKaRa），质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒购自Omega公司（Bio-Tek USA）。

表1 泡菜样品采集地列表Table 1 Places of collection of pickle samples

1.2 革兰染色初步鉴定

将泡菜样品在MRS培养基上划线接种，培养出菌落后挑取菌落继续划线分离2次，分离纯化泡菜样品中的细菌。MRS培养基是乳杆菌的半选择培养基，可以富集泡菜样品中的乳杆菌。挑取MRS培养基上的菌落进行革兰染色并在显微镜油镜下观察（×1 000）。革兰染色阳性，菌体为杆状的菌株初步鉴定为乳杆菌。

1.3 PCR 检出

利用我们设计的乳杆菌PCR快速检出技术[7]对革兰染色初步鉴定为乳杆菌的菌株进一步鉴定。该技术利用一对可以特异性扩增乳杆菌16S rDNA序列的引物（上游:5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGAT ATATGGAA-3′，下游:5′-GTGAT CCAGCCGCAGG TTCTCC-3′），直接挑取微量菌体为模板，特异性扩增长约850 bp的片段，可以快速鉴定乳杆菌。菌落PCR过程如下[8]:从菌落上挑取微量菌体，微波炉大火处理3 min后，加入到 PCR体系（25 μL）中进行扩增。然后取5 μL反应液进行琼脂糖凝胶（0.7 g/dL）电泳，凝胶上出现800 bp条带者鉴定为乳杆菌。

1.4 测序鉴定

利用通用引物（上游:5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'；下游:5'-AAGG AGGTGA TCCAG CCGC A-3'），PCR扩增细菌菌株16S rDNA全序列，扩增片段长度约为1 500 bp。使用胶回收技术纯化扩增片段，再用TaKaRa公司的T载体试剂盒，通过电转化，将目标扩增片段克隆到大肠杆菌中，然后提取重组质粒送大连宝生物公司测序。利用NCBI网站的BLASTn工具比对测序结果。最后根据测序结果将细菌菌株鉴定到种。

1.5 质粒提取

使用OMEGA质粒提取试剂盒提取乳杆菌质粒，操作步骤按照试剂盒说明书进行，只是在solution I中要加入1%的溶菌酶，同时增加37℃水浴10 min的处理步骤。用琼脂糖凝胶电泳检查提取结果。

2 结果与讨论

2.1 革兰染色结果

通过在MRS培养基上的划线分离和革兰染色鉴定，从52份泡菜样品得到43株菌株。其中6、8、9、25、38、41、44、45、49 号等 9 个样品未能在 MRS选择培养基中分离到菌株；其余样品各分离到3株菌株，各样品3株菌株的革兰染色结果均一致，故只保存3株菌株中的1株，菌株编号与样品编号相同。 其中 1、2、5、14、42号等共 5株菌株革兰染色阳性，菌体呈大卵圆形，初步鉴定为酵母菌；7、11、26～27、29、31～33、35～37、40、46、48 号等共 14 株菌株为革兰阳性球菌； 无革兰阴性球菌；3、10、12、13、15～24、28、30、34、39、43、47、50～52 号共 23 株菌株为革兰阳性杆菌；4号菌株为革兰阴性杆菌，见表2。

表2 泡菜样品分离菌株的革兰染色结果Table 2 Gram stain results of isolated strain from pickle samples

2.2 菌落PCR结果

对表2中列出的23株革兰阳性杆菌用特异性引物行 PCR 扩增， 电泳显示其中 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 号共 19 株菌株在 800 bp 左右出现清晰条带，其余13、30、50、51号等4株菌株无条带，见图1。从52个泡菜样品中鉴定到19株乳杆菌菌株，各地泡菜样品的乳杆菌检出率为36.5%。

图1 革兰阳性杆菌菌株的PCR鉴定电泳图（PCR引物为乳杆菌特异性引物）Fig.1 PCR detection of gram-positive Bacillus（using Lactobacillus-specific primer）

2.3 测序结果

对分离的23株革兰阳性杆菌菌株和5株革兰阳性球菌菌株进行了16S rDNA测序。利用NCBI网站的 BLASTn 工具比对显示，见表 3。 3、10、12、15～24、28、34、39、43、47、52 号共 19 株菌株被鉴定为乳杆菌；其它鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、有害片球菌（Pediococcus damnosus）、赫伦魏斯氏菌（Weissella hellenica）、 蜡 样 芽 胞 杆 菌 （Bacillus cereus）、 表 皮 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus epidermidis）、 巴 氏 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus pasteuri）等。测序鉴定结果和乳杆菌PCR快速检出结果吻合。19株乳杆菌分离株中仅鉴定为两种乳杆菌:清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），其中清酒乳杆菌1株，植物乳杆菌18株。13株植物乳杆菌的16S rDNA序列和植物乳杆菌WCFS1（Lactobacillus plantarum WCFS1）的相似性为100%，只有5株植物乳杆菌的16S rDNA序列和植物乳杆菌WCFS1分别有1、2、6、8个碱基的差异，相似性分别是99.9%、99.6%和99.5%。15和24号植物乳杆菌分离株和植物乳杆菌WCFS1的16S rDNA序列相差同一个碱基，即15和24号植物乳杆菌两菌株之间的相似性为100%。

表3 泡菜样品分离菌株的16s rDNA测序结果列表Table 3 16s rDNA sequencing results of isolated strains from pickle samples

图2 19株乳杆菌分离株的质粒提取电泳图Fig.2 Plasmid extracts electrophoresis of 19 isolated Lactobacillus strains

2.4 质粒提取结果

提取19株乳杆菌分离株的质粒，见图2。清酒乳杆菌没有提到质粒，18株植物乳杆菌中7株没有质粒，有质粒的植物乳杆菌菌株共11株。从电泳图来看有10种质粒谱型，见表4。18株植物乳杆菌分离株在质粒谱型上表现出了遗传差异。 提示泡菜中蕴藏着丰富的乳杆菌质粒资源。有质粒的乳杆菌分离株分别来自成都、绵阳、眉山、峨眉山、宜宾、乐山、雅安、凉山和阿坝共9个地方，分布地域较广。从地理分布上看，有些地区有多种质粒谱型，有些地区的质粒谱型和别的地区一样，例如:成都有P6和P9两种质粒谱型，眉山有P2和P5两种质粒谱型，峨眉山、宜宾和乐山的质粒谱型都是P8。这提示乳杆菌质粒的分布不是平均的，明显存在地区差异。

表4 19株乳杆菌分离株的质粒谱型列表Table 4 Plasmid profiles of 19 isolated Lactobacillus strains

3 结语

本研究是对中国泡菜中的乳杆菌和乳杆菌质粒资源的初步调查，共分析了52份泡菜样品。调查表明，36.5%的泡菜样品中含有乳杆菌。理论上泡菜是植物制品，在制作中容易携带生长在植物表面的植物乳杆菌，所以从泡菜分离的乳杆菌绝大多数应该是植物乳杆菌。四川地区的一次对泡菜中乳杆菌资源的调查中分离了260余株乳杆菌，其中植物乳杆菌141株，占50%以上[9]，东北的泡菜中也分离到了多株植物乳杆菌[10]。这些研究表明，植物乳杆菌是泡菜中的优势乳杆菌。我们共分离了19株乳杆菌菌株，其中植物乳杆菌就有18株，这和理论以及之前的研究结果是相吻合的。江苏扬州地区调查了3种泡菜，发现的却是嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），没有植物乳杆菌[11]，这可能是样本太少的结果，也可能是地区差异所致。从地理分布上看，来自辽宁以及四川的成都、绵阳、松潘、资阳、眉山等地的泡菜样品中皆分离到了乳杆菌。乳杆菌的分布没有出现明显的地域差异。在极为邻近区域，有的泡菜样品中有乳杆菌，有的却没有。例如:采集自成都金牛区不同地点的 1、15、37、49、38 和 39 号泡菜样品只有15和39号分离到了乳杆菌；采集自成都青白江相邻3个镇的50、51和52号泡菜样品只有52号样品分离到乳杆菌。这可能是泡菜制作手法不同造成的。

本研究共检出乳杆菌质粒谱型9种（不含无质粒的谱型），检出含质粒乳杆菌11株，乳杆菌质粒检出率为21.2%，乳杆菌质粒谱型检出率为17.3%。52份泡菜样品中28份采集自四川成都，占样品总数的53.8%，从中分离出6株植物乳杆菌，两种质粒谱型 （P6和P9）。成都地区的乳杆菌检出率为21.4%，低于此次调查的乳杆菌总检出率（36.5%）。成都地区的乳杆菌质粒谱型检出率为7.1%，远低于此次调查的乳杆菌质粒谱型总检出率 （17.3%），这表明扩大样品采集区间，而不是在狭小地域密集采样有利于乳杆菌检出率以及乳杆菌质粒谱型检出率的升高。如果在广大的地域采集更多的样品，一定能检出更多的乳杆菌质粒谱型。我们的初步调查可以确定的是:中国泡菜中蕴藏丰富的乳杆菌质粒资源，值得进行更大规模的调查和研究。

乳杆菌是公认安全的微生物，是目前的研究热点之一[12]，其质粒是研究乳杆菌遗传和生理的重要材料，也是进行基因工程的潜在载体。发掘中国泡菜中的乳杆菌质粒具有重大的研究和应用价值。

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