硫辛酸对高脂日粮小鼠脂代谢紊乱及氧化应激的调节作用

李龙囡 ， 王艳艳 ， 尹彩娜 ， 王舒平 ， 孙 进 ， 乐国伟 1，， 施用晖 *1，

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122）

脂类是机体重要的营养和能量物质，但长期高脂膳食将导致机体氧化应激，氧化应激是引发高血脂症、动脉粥样硬化及肥胖等代谢疾病的根源[1-3]。脂代谢过程涉及载脂蛋白、脂蛋白受体等，而脂蛋白脂酶（LPL）和肝脂酶（HL）作为脂蛋白代谢中的两个关键酶，在脂代谢中发挥着重要的调控作用[4]。此外，载脂蛋白 E（apolipoproteinE，ApoE）作为血浆主要的载脂蛋白之一，与血浆脂蛋白代谢，LDL、CM残粒进入肝细胞代谢相关[5]。肉碱棕榈酰转移酶（carnitine palmitoyltransferaseIa，Cpt1a） 是脂肪酸氧化过程中的一种限速酶[6]，它催化长链脂酰辅酶A与肉碱合成脂酰肉碱，并转运至线粒体基质而被氧化分解，在能量代谢中起重要作用。

已有研究证明，抗氧化剂硫辛酸（LA）能缓解高脂日粮导致的氧化应激及血脂代谢紊乱[7-8]，而进一步研究LA对血浆脂酶活性及ApoE、Cpt1a mRNA表达的影响，有助于深入认识机体氧化还原状态对脂代谢的调节作用，为高脂引发的血脂紊乱机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

硫辛酸:江苏常熟富士莱医药化工有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）和丙二醛（MDA），总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C、LDL-C），脂蛋白脂酶（LPL）及肝脂酶（HL）试剂盒:南京建成生物工程研究所；Trizol:Invitrogen公司；荧光染料Evagreen:Biotium公司；冷冻高速离心机:eppendurgh公司；ABI-7000荧光定量 PCR仪。

1.2 动物实验的设计

清洁级C57BL／6雄性小鼠40只，预饲1周后，根据体重随机分为4组:对照组（正常日粮），高脂组（高脂日粮，含20.0%脂肪），LA组（高脂日粮分别添加0.05%和0.1%LA）。正常日粮和高脂日粮配方见表1。小鼠同室分笼饲养，光暗周期12 h，自由采食和饮水，每周称一次体重。环境温度控制在（23±2）℃，湿度60%，小鼠饲养6 w后处死。

表1 正常日粮和高脂日粮配方Table 1 Compositions of normal and high fat diet

1.3 血样及组织样品采集

小鼠饲喂6周后眼球取血，放入抗凝管测定全血ROS水平，其余离心于（4℃、3 000 r/min离心10 min），取上层血浆于-20℃保存备用。

断颈椎处死小鼠后，取肝脏、胰腺、胃、十二指肠、空肠及回肠迅速在预冷的生理盐水中漂洗除去血液，滤纸拭干，精确称重相同部位组织，加入预冷的生理盐水于冰浴下匀浆制得10 g/dL组织匀浆，测ROS水平，其余组织匀浆于-20℃保存备用。取0.1 g肝脏组织迅速加入trizol中，-80℃保存以备RNA提取。

1.4 指标的检测

1.4.1 全血及组织自由基水平的测定 参照luminol化学发光法[9-10]测定，使用MPI-B型多参数化学发光检测仪检测，发光强度表示自由基水平。

1.4.2 血浆和组织匀浆中酶活测定 肝脏中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）和总抗氧化能力（T-AOC），血浆中脂蛋白脂酶（LPL）及肝脂酶（HL）活性及血脂指标均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.3 肝脏组织ApoE、Cpt1a的RT-PCR检测 一步法提取肝脏总RNA、反转录。RT-PCR:通过NCBI中查出小鼠ApoE、Cpt1a的基因全序列，应用Primer5.0引物设计软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表2。用ABI-7000定量PCR仪，进行Real-time RT-PCR扩增。 PCR 反应体系（25 μL）:10×PCR 缓冲液（含 1.5 mmol/L Mg2+）2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，无菌水 16.5 μL，SYBR green（20×）1.25 μL。PCR 扩增条件:94℃变性 3 min，55℃退火1 min，72℃延伸75 s为第一个循环。94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min为第二个循环，共30个循环。终末72℃延伸10 min。检测各模板的Ct值，通过Ct值进行相对定量。

表2 β-actin、Cpt1a和ApoE引物序列Table 2 Sequence of the primers for β-actin、Cpt1a and ApoE （F：Forward；R：Reverse）

1.5 数据处理和统计分析

2 结果与分析

2.1 高脂日粮和LA对小鼠体重的影响

高脂组小鼠体重6w后显著（P＜0.05）高于正常组。在高脂日粮中添加0.05%LA，与高脂组相比，体重有所下降，但差异不显著，而添加0.1%LA体重显著降低（P＜0.05），结果见表 3。

表3 小鼠体重变化Table 3 Change of body weight

2.2 LA对高脂日粮小鼠全血和各组织氧化还原状态的影响

与正常组相比，高脂组小鼠肝脏、胰腺、胃、十二指肠、空肠及回肠ROS水平显著（P＜0.05）升高，见表4。其中以十二指肠、空肠最为显著。而添加0.05%LA有降低各组织ROS水平的趋势，添加0.1%LA则使其自由基显著降低（P＜0.05），并接近对照组水平。

表4 高脂日粮和LA对小鼠全血及组织自由基的影响Table 4 Effect of LA and high-fat on free radicals in whole blood and tissues of mice （n=8，±s）

表4 高脂日粮和LA对小鼠全血及组织自由基的影响Table 4 Effect of LA and high-fat on free radicals in whole blood and tissues of mice （n=8，±s）

注:不同组之间字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

组织 对照组全血(103cd/μL) 0.11±0.03a肝脏(103cd/mg) 5.81±1.30a胃(103cd/mg) 4.02±1.28a胰腺(103cd/mg) 4.20±1.50a十二指肠(103cd/mg) 8.71±2.25a空肠(103cd/mg) 8.04±1.68a回肠(103cd/mg) 4.07±1.99a高脂组0.30±0.09b 9.85±3.22b 6.35±0.62b 8.50±2.10b 20.53±2.65b 12.23±1.17b 8.48±2.29b高脂+0.05%LA 高脂+0.1%LA 0.23±0.05b 0.11±0.05a 7.06±2.80b 4.92±1.80a 5.09±0.81ab 4.15±0.62a 5.90±2.30ab 4.20±2.00a 16.78±1.05b 9.57±2.50a 10.04±0.76b 7.97±1.50a 8.38±1.92b 3.36±1.52a

高脂日粮和LA对小鼠肝脏抗氧化酶活性和总抗氧化能力的影响见表5。与正常组相比，高脂组GSH-Px、CAT 及 T-AOC 显著下降 （P＜0.05）。 添加0.1%LA，小鼠肝脏抗氧化能力都显著 （P＜0.05）升高，而添加0.05%LA则效果不显著。

表5 高脂日粮及LA对小鼠肝脏氧化还原状态的影响Table 5 Effect of LA on liver antioxidant index of high-fat fed mice（n=8，±s）

表5 高脂日粮及LA对小鼠肝脏氧化还原状态的影响Table 5 Effect of LA on liver antioxidant index of high-fat fed mice（n=8，±s）

注:不同组之间字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

CAT/（U/mg） 5.30±0.50a GSH-Px/（U/mg） 5.90±0.81a T-AOC/（U/mg） 1.79±0.12a高脂+0.05%LA 高脂+0.1%LA 3.51±0.73b 5.57±0.58a 3.16±0.89b 5.06±0.56a 0.79±0.11b 1.51±0.60a指标 对照组 高脂组2.60±0.21b 2.01±0.21b 0.43±0.02b

2.3 LA对高脂日粮小鼠肝脏及血浆MDA含量的影响

高脂日粮摄入可显著（P＜0.05）提高小鼠血浆及肝脏MDA含量，造成脂质过氧化，在高脂日粮基础上添加0.1%LA可显著降低小鼠血浆及肝脏中MDA 含量（P＜0.05），而添加 0.05%LA 则效果不显著，见图1。

2.4 LA对高脂日粮小鼠血脂的影响

由表6可知，与正常组相比，高脂组小鼠血浆中TCH、TG、LDL-C含量均显著增高，HDL-C显著降低（P＜0.05）。添加0.1%LA可显著改善高脂导致的血脂异常，而0.05%LA的添加量作用不显著。高脂组动脉粥样硬化指数（AI）显著高于正常组，且高达正常组的3倍多，而添加0.1%LA则可显著降低AI值（P＜0.05），添加 0.05%LA 有降低的趋势但不显著。

图1 高脂日粮及LA对小鼠血浆和肝脏MDA含量的影响Fig.1 Effect of LA on live and plasma MDA in high-fat fed mice

表6 LA对高脂日粮小鼠血脂水平的影响Table 6 Effect of LA on plasma lipid in high-fat fed mice（mmol/ml）（n=8，±s）

表6 LA对高脂日粮小鼠血脂水平的影响Table 6 Effect of LA on plasma lipid in high-fat fed mice（mmol/ml）（n=8，±s）

注:不同组之间字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

组别 TG对照组 1.28±0.22a高脂组 2.00±0.11b高脂+0.05%LA 1.42±0.29ab高脂＋0.1%LA 1.28±0.36a TCH 2.07±0.45a 3.43±0.19b 2.41±0.31ab 2.33±0.14a LDL-C 0.87±0.07a 1.30±0.16b 1.29±0.04b 0.97±0.07a HDL-C 0.56±0.11a 0.35±0.06b 0.38±0.04b 0.54±0.04a AI 1.35±0.58a 4.80±1.32b 2.77±0.82b 1.63±0.90a

2.5 LA对高脂日粮小鼠血浆LPL、HL活性的影响

高脂组小鼠与正常组相比，血浆肝LPL、HL的活性均显著降低（P＜0.05），见表 7。添加 0.05%LA 有提高其活性的趋势，但不显著；0.1%的添加量作用显著（P＜0.05），可使其恢复接近正常组。

表7 LA对高脂日粮小鼠血浆LPL和HL活性的影响Table 7 Effect of LA on plasma LPL、HL in high-fat fed mice（n=8，±s）

表7 LA对高脂日粮小鼠血浆LPL和HL活性的影响Table 7 Effect of LA on plasma LPL、HL in high-fat fed mice（n=8，±s）

组别 HL/(U/mg)对照组 0.83±0.01a高脂组 0.69±0.01b高脂+0.05%LA 0.70±0.04ab高脂+0.1%LA 0.77±0.01a LPL/(U/mg)0.85±0.01a 0.64±0.01b 0.65±0.01b 0.85±0.02a

2.6 LA对高脂日粮小鼠肝脏Cpt1a及ApoE表达的影响

由图2可知，与正常组相比，高脂组小鼠肝脏ApoE mRNA的表达显著上调，而Cpt-1a mRNA表达显著下调（P＜0.05）。在高脂日粮中添加0.05%LA即可显著（P＜0.05）下调ApoE mRNA的表达，添加量达到0.1%，可使其表达量接近于对照组。高脂日粮中添加0.1%LA可显著（P＜0.05）上调Cpt1a mRNA表达量，而添加0.05%LA后上调作用不显著。

图2 高脂日粮及LA对小鼠肝脏ApoE及Cpt1a mRNA表达的影响Fig.2 Effects of LA on expression of ApoE （a）and Cpt1a（b） mRNA in liver of mice fed with high-fat diet

3 结语

氧化损伤与能量代谢之间存在着显著的相互作用，长期高脂饮食使代谢水平增高，细胞耗氧增加，ROS过量，过量的活性氧会引起蛋白质、脂肪等生物大分子的氧化损伤，损害肝细胞的完整性从而影响脂质代谢[11]，所以氧化应激是肥胖、糖尿病等慢性疾病发生的根源之一[12]。在本研究中，高脂日粮导致小鼠氧化应激，各组织自由基水平显著升高，肝脏CAT、T-AOC和GSH-Px含量较正常组明显下降，脂质过氧化产物MDA显著升高，通过降低血浆HL和LPL活性导致脂代谢紊乱，而添加0.1%LA可明显改善这种脂代谢紊乱，缓解氧化应激。LA是脂溶和水溶的两性分子[13]，这使其能以较高的浓度存在于细胞内外，发挥清除自由基的作用，同时能与VE和Vc的氧化还原反应耦连，使其发挥抗氧化作用，缓解机体营养性氧化应激。从而降低TG、TCH和LDL，并提高HDL，调节脂质代谢紊乱，这与国外的研究结果一致[14]。

线粒体是体内产能的主要场所，能量产生主要通过脂肪酸β-氧化和葡萄糖代谢。在脂肪酸β氧化过程中，Cpt1a是其中的一种限速酶，能够根据组织的能量需求调整脂肪酸氧化。生理情况下，Cpt1a表达受丙二酰辅酶A的抑制，而丙二酰辅酶A的合成又受乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的调节；高脂饮食可以通过诱导ACC的活化及增加丙二酰辅酶A的浓度而抑制Cpt1a的表达[6]。Cpt1a mRNA水平降低将影响脂肪酸转运入线粒体进行β-氧化实现能量生成，使已进入细胞的脂肪酸及其活化产物脂酰辅酶A沉积在胞质内，造成大量脂质堆积[15]，从而机体出现脂代谢紊乱。另一方面，血脂、胆固醇的增加可减少脂肪酸进入线粒体，防治自由基的生成。本实验中，在高脂日粮中添加0.1%LA可显著降低ROS水平，使小鼠肝脏Cpt1a表达显著上调，增强脂肪酸β氧化，缓解高脂引起的血脂异常。

载脂蛋白E在脂代谢循环中作为一种血清糖蛋白配体，主要存在于乳糜微粒及其残体、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白亚群颗粒中，通过与LDL受体及其相关蛋白、VLDL受体相互作用帮助血浆中脂蛋白脂解与清除，并调控VLDL和TG的浓度，在胆固醇和脂蛋白代谢中发挥关键作用，是脂类代谢和心血管疾病的决定因子[5]。有趣的是，高脂饲喂小鼠肝脏ApoE表达显著高于正常组，血浆TG含量显著升高，而添加10%LA干预后ApoE表达量显著降低。有临床研究表明血浆TG水平变化有20%到40%与ApoE有关。在ApoE基因缺陷小鼠的体内外实验中发现，其肝细胞分泌的VLDL的TG含量较野生型小鼠显著减少，如果肝脏ApoE表达增加，则可使VLDL的TG含量增加。转入ApoE3于ApoE缺陷型小鼠中，使其高水平表达，可使血浆TG含量比正常高3倍。这可能是由于高水平的ApoE刺激VLDL中TG合成增加及特异地抑制LPL对TG的水解所致[16]。本实验也发现高脂饮食小鼠LPL活性显著降低。ApoE与血浆胆固醇含量也密切相关，ApoE参与介导VLDL和CM残粒的清除。而据报道，在敲除LDL受体基因小鼠中利用腺病毒使ApoE表达增加，可使血浆胆固醇水平显著降低[17]。但也有研究用腺病毒转载ApoE于ApoE敲除小鼠中，发现即使低水平的ApoE表达也能使其血胆固醇降低。如果同时敲除ApoE和LDL受体基因，则只有中等水平ApoE表达才能使胆固醇水平下降[18]。ApoE对脂代谢的影响还有待深入研究。

综上所述，本研究证实了LA对小鼠脂代谢紊乱，氧化应激的改善作用，初步推测这种作用可能是通过改善小鼠肝脏Cpt1a和ApoE的表达实现的，至于具体的机制有待进一步的研究。

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