人脐带间充质干细胞向血管内皮细胞的定向分化及临床应用进展

杨 雯，惠 玲，吕同德

间充质干细胞是1974年被科学家Friedenstein等［1］首次从骨髓细胞中分离并鉴定的新型干细胞，主要存在于中胚层，是一种具有自我复制能力的多潜能细胞。这种细胞普遍存在于动物骨膜、松质骨及脂肪组织中［2］，且在一定条件下可以诱导分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞及支持造血的基质等。其弱的免疫原性在很大程度上降低了移植物抗宿主病的发生概率，使其成为细胞组织工程与细胞水平疾病治疗的一个重要来源。特别是近年随着干细胞治疗越来越广泛地应用于临床研究与治疗，一种新的间充质干细胞来源——人脐带间充质干细胞(humanbeing mesenchymal stem cells，hUCMSCs)受到研究者普遍关注并且成为干细胞领域的一个研究热点［3］。hUCMSCs是存在于脐带华通胶(Wharton's jelly)和血管周围组织中的一种干细胞，直到2003年才被Mitchell等［4］和 Romanov 等［5］成功地从人脐带基质中分离出来，从此引起了研究者的广泛关注。此类细胞外观呈梭形或多角形，具有细胞核，可高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记，几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。作为一种新型的原始干细胞，hUCMSCs与传统骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞等相比具有许多优点，如较强的多向分化能力及在再生医学细胞组织工程中的潜在应用。Seda等［6］报道的软骨疾病最新治疗方案探索的文章中证明了间充质干细胞作为软骨组织工程细胞在这一类疾病的治愈过程中发挥着很大作用，特别是hUCMSCs向血管内皮细胞定向分化这一特性，使其可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗，引起了研究者们的广泛关注。本文就hUCMSCs向血管内皮细胞的定向诱导分化以及其在血管内皮组织工程中的应用做简要综述，并对这一领域存在的问题及可能的研究方向进行展望。

1 hUCMSCs向血管内皮细胞的诱导分化

1.1 血管生成素-1(Ang-1)的调节作用 Ang-1是由血管周围间质细胞及平滑肌细胞分泌的一种糖蛋白，它通过与内皮细胞特异性表达的酪氨酸激酶受体结合，使其磷酸化，通过信号转导对新生血管的形成进行调节［7］。Ang-1在脐带间充质干细胞向内皮细胞分化的过程中扮演着不可替代的角色。有研究发现，Ang-1/Tie系统具有抑制新生血管形成和减少血管渗漏的特点，同时可促进血管的成熟。Baffert等［7］提出人血管生成素属于分泌型细胞因子家族成员，依据其氨基酸序列差异分为 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4和Ang/Tie-2系统。实验研究发现在动物血管内皮细胞坏死部位Ang-2表达上调，而Ang-1不改变或轻微增加，使病变部位 Ang-2和Ang-1之间的平衡被破坏，其比值上调。在脐带间充质干细胞向内皮细胞分化的过程中，Ang-1有着不可替代的调节作用，这一发现为后续hUCMSCs的应用研究奠定了理论基础。

近年来，内皮前体细胞(EPC)已被尝试用于治疗领域。有研究人员在实验中将EPCs经过体外扩增于下肢缺血或心肌缺血的动物模型体内输注，发现可成功地促进新血管生成，缓解缺血状况［8］。然而内皮细胞受到衰老及疾病等多方面因素影响，使其临床应用受到极大限制，故构建新型高效稳定血管内皮组织工程，并将其合理地应用于临床来促进血管再生则可能成为克服这些潜在问题的手段。

Kim等［9］通过构建腺病毒载体用目的基因转染hUCMSCs，此法为细胞依赖的基因治疗方法之一。萧鸿等［10］通过构建Ang-1基因真核表达载体，并采用Western blot法检测其在hUCMSCs中的表达。他们成功地用RT-PCR克隆来了人Ang-1基因序列片段，编码区序列，纯度为1182，PCR扩增的片段长度为115 kb，与预期片段大小相近。双酶切鉴定重组pEGFP-N1-Ang-1转染质粒显示目的基因与预期基因序列的同源性为100%。这一病毒载体构建的感染细胞，为进一步研究Ang-1防治糖尿病视网膜病变的血管渗漏提供了实验依据，使人们对于hUCMSCs的生长分化控制又多了一条途径。

1.2 血管内皮生长因子(VEGF)的促进作用VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为重要的生长因子，在病理性及生理性血管新生方面发挥着独特作用。在血管新生过程中，VEGF和bFGF之间具有协同作用，共同促进CD34+细胞向内皮细胞转化，从而促进血管新生。VEGF最早是从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化得到，后研究发现其广泛分布于人和动物的脑、肺、肝、脾、肾和眼等组织。众所周知，肿瘤生长和转移依赖于新生血管形成，而VEGF作为一种很强的促进血管新生的因子，可在肿瘤患者体内高效表达，当治愈时VEGF表达水平则会迅速下降。因此，在理论上VEGF以其高表达作为肿瘤治疗的靶点，为标记生长旺盛的肿瘤组织进行追踪的靶向给药治疗。Zayed等［11］通过构建CIB1缺陷小鼠证明了VEGF可促进内皮细胞向血管方向分化，从而使得我们从细胞水平上对缺血性疾病的血管再生有了更加深入的了解。

此外，多项研究发现VEGF在脐带间充质干细胞中的表达上调，可有效刺激其向血管内皮细胞方向分化，同时可促进其他细胞的血管内皮细胞分化。例如长久以来糖尿病溃疡的再生修复一直是困扰临床医生的一大难题，而糖尿病溃疡不容易愈合的一个重要因素就是其溃疡局部VEGF浓度显著下降。这就意味着可通过向创伤部位添加VEGF来帮助溃疡愈合，而且这种方法也被证明是非常有效的。Mayer等［12］研究发现VEGF在间充质干细胞中表达增高时可增加新生血管形成以达到加速骨折愈合的效果。VEGF对hUCMSCs促血管内皮细胞分化作用使得其在肾脏疾病的治疗领域也开始扮演了一个显著的新角色，通过微血管的再生来改善肾脏的缺血坏死。此外，孙洞箫等［13］对IgA肾病模型小鼠静脉输注hUCMSCs，观察hUCMSCs移植对 IgA肾病小鼠肾功能及肾组织的影响。结果发现，hUCMSCs移植对IgA肾病小鼠肾功能具有保护作用，其机制可能与上调了肾组织中VEGF表达有关。这一研究结果为临床治疗肾脏创伤提供了一些新的思路，而且VEGF在hUCMSCs定向分化过程中的作用机制又得到进一步的发展与证实。除VEGF外，其实还有很多细胞因子可影响间充质干细胞向内皮方向分化。Chen等［14］通过分组给予急性肾损伤大鼠注射hUCMSCs和肝细胞生长因子诱导hUCMSCs，经大量实验研究发现诱导后的细胞经颈动脉注入后，疗效较单细胞治疗组更显著。RT-PCR和Western blot结果显示细胞凋亡蛋白酶、白细胞介素等均不同程度地下调。

1.3 条件培养液诱导的hUCMSCs向血管内皮细胞方向分化 细胞外的微环境对hUCMSCs的特定分化有重要意义，不同条件诱导可决定细胞的不同分化方向。因此，通过改变培养环境中氧含量或接种密度抑或向特定时期生长状态良好的hUCMSCs培养基中加入一些特殊调节物质，可很好地促进其向脂肪、骨、肝细胞、血管内皮细胞等进行分化。Kafienah等［15-16］对骨髓间充质干细胞在低氧等一系列条件培养基的诱导下向软骨细胞分化，用所得细胞对软骨退行性疾病进行细胞组织工程治疗做了大量体内外实验，并且取得了理想的结果。

这一细胞培养技术实现了人们对hUCMSCs的分化可控调节，达到人们对目的细胞的需求，进而为临床研究与应用提供理论基础。陈恩等［17］通过将生长状态良好的P3-P6的hUCMSCs培养于内皮分化诱导培养基(即5%的胎牛血清、100 ng/ml血管内皮生长因子、50 ng/ml表皮生长因子和1%抗生素的LG-DMEM细胞培养液)，置37℃，5%的 CO2的培养箱中培养2 d，每3天换一次液。实验中通过免疫荧光技术检测特异性内皮蛋白的表达，结果发现经过诱导培养基培养后hUCMSCs表达3种内皮细胞特异性蛋白，即血管内皮生长因子2(FLK-1/VEGF2)、von Willebrand 因子(von Willebrand factor，Vwf)和血管内皮黏附素复合体(vascular endothelialcadherin，VE-cadherin)。他们还通过 Real-Time PCR检测内皮细胞特异性基因的表达、微血管形成能力鉴定内皮分化和低密度脂蛋白吸收能力鉴定内皮分化等一系列的实验进一步证实了内皮分化诱导培养基能够促进其向血管内皮细胞分化演进，可为构建内皮组织工程提供新的种子细胞来源。

2 hUCMSCs的临床应用

2.1 心血管疾病方面 近年，缺血性疾病，特别是心血管疾病的发病率在全世界范围内明显上升，严重影响着人们的健康、制约着社会和经济的发展。在我国每年因冠心病需要移植血管行冠状动脉搭桥术者有十多万，因下肢静脉疾病、血管先天性异常和创伤等原因需接受手术的患者更多，需大量合适的血管移植物。当今临床应用的代替材料主要是来自于国外，但这些材料有弊端，如移植后容易形成栓子、免疫排斥，移植一段时间后生物学功能的丧失等。为解决这些问题，探寻新的可再生移植材料成了广大学者的工作重心。Zhou等［18］利用大鼠进行hUCMSCs局部移植来治疗脊髓损伤引起的运动障碍，疗效显著。Ding等［19］将 hUCMSCs移植到大脑中动脉栓塞模型大鼠的脑皮质内，结果发现接受hUCMSCs移植的大鼠躯体不对称性显著减轻，自主活动明显减少，而自发活动显著增加;梗死区皮质神经元的神经生理活性显著增加;缺血半暗带内表达胶质原纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和神经元核抗原的细胞比例分别为9%、6%和6%;缺血区的巨噬细胞或小胶质细胞数目和β1-整合素的表达水平显著增加;缺血区微血管灌注、半暗带内神经血管密度以及缺血区皮质脑血流均显著增加，且趋化因子-1、胶质酸GDNF和BDNF的表达水平为对照组的2．0～3．5倍，使缺血病变得到缓解。在心肌梗死的治疗中，hUCMSCs作为一种原始干细胞，本身就具有很强的增殖能力，同时免疫原性也达到了最低限度。在心血管支架的构建中，这种细胞具有很高的生物活性，可允许其他细胞黏附、生长和机化，完全与移植后的机体吻合，发挥生物学活性。

近年来，研究者通过向实验模型缺血坏死部位或静脉注射hUCMSCs，发现坏死部位出现血管再生修复，这一发现引起了人们的极大兴趣。杜磊［20］建立大鼠脑缺血坏死模型，然后于坏死部位注射hUCMSCs，结果发现移植组大鼠改良神经功能缺损评分(mNSS)较对照组有明显改善。免疫荧光染色证明，移植28 d后不但有一定数量hUCMSCs在宿主脑内成活，并且其中大部分细胞表达NSE、MAP2、GFAP、CD31和vWF等，同时也促进了大鼠脑神经的恢复。Koh 等［21］和 Cao等［22］也通过实验证实hUCMSCs治疗大鼠缺血性疾病效果显著。Liao等［23］向脑卒中模型的裸鼠皮下注射MSCs混合物，饲养21 d后观察发现，实验组出现大量粗细不等的血管，行切片HE染色后镜下观察发现实验组中含有大量血管结构，腔内有血液;而空白对照组中基本观察不到血管结构。王娟等［24］通过经外周静脉输注hUCMSCs治疗长期肝硬化也取得了相当可观的效果。与此同时hUCMSCs的低免疫原性优点使得其近年来取代了病毒介导的基因治疗，成为治疗急性肾损伤的又一方法。

2.2 烧伤方面 火灾及交通事故等经常会发生严重的体表烧伤。虽然部分损伤可通过美容整形修复，可是其昂贵的费用以及巨大的伤害，让患者难以接受。无论是自体还是异体皮肤移植，手术成功的关键均是移植皮肤血管网的建立。研究表明，皮肤移植后营养来源按发生先后可分为3个阶段，即早期、中期和晚期［25］。对临床皮肤移植手术成功患者进行深入研究均可发现，移植后从中期开始皮片中即有血管网结构与创面基底残存血管进行断端吻合，后期便开始有新生血管形成，为移植皮肤提供营养。组织工程皮肤、组织工程化复合皮肤和脱细胞真皮支架等均给需植皮的患者带来极大希望，然而这些研究结果因不具备血管网结构、组织工程皮肤血管化受阻而停止。

胡克苏［26］采用分离纯化的hUCMSCs治疗深度烧伤大鼠，发现hUCMSCs可加快深度烧伤愈合同时还能抑制局部炎性反应，促进血管形成和成纤维细胞增殖，参与损伤修复。表皮干细胞、脂肪干细胞和间充质干细胞作为细胞种子在烧伤中的作用十分重要。当注入干细胞时，这些细胞就会分泌一些细胞因子，并在这些趋化因子的作用下向受损部位游走，进而形成一些微血管对皮肤进行修复。不少研究表明，MSCs参与了创面愈合过程，并已经证实MSCs在创面微环境的作用下，通过表型发生变化形成表皮细胞或成纤维细胞等和正常修复细胞共同参与烧伤创面的修复。这些研究结果不仅解决了移植物寻求方面的困扰，而且其本身向血管内皮细胞方向分化的特性也使得组织工程皮肤中的皮肤血管分化问题迎刃而解。

2.3 糖尿病并发症方面 随着人们生活水平提高，糖尿病逐渐成为当今社会威胁人们健康的代谢性疾病之一，其并发症如糖尿病足坏疽、糖尿病视网膜病变等给患者带来极大的痛苦。对糖尿病及其并发症治疗的探索成了科研和临床需解决的重大问题。

hUCMSCs的研究与应用为糖尿病治疗开辟了新的途径。近年有学者将出把骨髓间充质干细胞或hUCMSCs植入胰腺这一特定环境中，干细胞会朝着胰岛素分泌细胞定向分化，从而降低血糖［27］。干细胞作为组织工程的种子细胞在体外可被诱导分化为视网膜神经样细胞，诱导出的细胞表达神经干细胞的特征性标志物。近年有学者建立了通过静脉注射hUCMSCs治疗糖尿病视网膜病变的大鼠模型，结果发现这一方法可以使病变得到一定程度的改善。刘弘光等［28］采用贴壁生长的大鼠骨髓间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共同培养使间充质干细胞分化为胰岛样细胞，结果发现将这些胰岛样细胞于尾静脉移植给STE诱导的糖尿病大鼠，能明显缓解糖尿病病情。樊明世［29］通过实验研究发现hUCMSCs可使兔的糖尿病足部病变改善，皮温增高，侧支循环建立增多，毛细血管数量增加。这些研究都为糖尿病并发症的治疗与控制提供了一种有效安全的方法，使坏疽截肢率大大降低，从而改善患者的生活质量［30］。通过大量学者的研究与实验，我们不难发现在不久的将来干细胞治疗将可能成为糖尿病及其并发症治疗领域的重要方法。

3 展望

在间充质细胞的研究与治疗领域，hUCMSCs因简单易得、低免疫原性及多方面可分化性等诸多优点，已成为干细胞研究的重点。hUCMSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可为实验和临床提供充足的细胞来源，可利用其克隆得到稳定的细胞系作为组织细胞工程的种子。近年越来越多的学者致力于这方面的研究，利用不同诱导方法及诱导因子来获得大量脂肪、神经、骨细胞、软骨细胞等，为临床工作提供来源稳定的组织工程细胞，特别是其向血管内皮干细胞分化这方面，为临床上困扰患者和医师的许多难题带来了解决的可能。

然而，目前的研究工作中也面临着诸多难题。首先，虽然hUCMSCs是一种原始祖细胞，但是也存在着细胞的衰老与凋亡。现阶段重要的任务之一就是尽可能地添加一些抗衰老因子及抗氧化剂等，使hUCMSCs发挥最大的分化潜能;与此同时应研究hUCMSCs向血管内皮细胞分化过程中的关键性调控因子，在更高一层的领域实现对这一分化过程的靶向基因调控，并且逐步实现其临床应用，为人类健康与社会发展提供更好的保障。

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