多糖硫酸酯化修饰及其抗凝血作用研究进展

尹馨梓，张佩华，2，陈士国，叶兴乾*

1浙江大学生物系统工程与食品科学学院农产品加工实验室，杭州310058;

2浙江省质量检测科学研究院，杭州310013

硫酸酯化多糖是一类单糖分子上羟基被硫酸根取代的多糖，也称硫酸多糖或多糖硫酸酯。硫酸多糖具有广泛的生物活性，除最主要的抗凝血［1］作用外，还具有抗肿瘤［2］、抗病毒［3］，抗HIV［4］活性等，而且大多无毒［5］，因而受到极大的关注。硫酸酯化多糖包括天然和化学修饰的硫酸多糖［6，7］，包括从海洋多糖，肝素，植物中提取的各种硫酸多糖以及人工合成的多糖硫酸酯。硫酸酯化多糖的化学结构对其生物活性有着重要的影响［8］，因而其构效关系在国内外得到重点关注和研究［9］。

抗凝血活性是硫酸多糖的一个非常重要的生物活性，近几年硫酸多糖抗凝血作用的构效关系也成为热点之一。本文就近几年天然以及合成的硫酸多糖的修饰方法、多糖硫酸酯以及硫酸多糖的抗凝血活性及其影响因素、构效关系等方面进行综述。

1 硫酸化方法

对不含有或者含有硫酸基量少的物质进行硫酸化修饰就是化学法硫酸化多糖的过程。硫酸化过程，即磺酸基团与多糖的羟基发生酯化反应的过程。整个反应体系主要包括酯化剂和溶剂两部分。常用的酯化剂主要有:浓硫酸、氯磺酸、三氧化硫、二氧化硫和氧气等。但是这些酯化剂存在共同的缺点:它们的酸性太强，在反应过程中会导致多糖分子链发生强烈的降解。为了降低多糖分子链的水解和降解，且同时提高多糖的溶解性，有机溶解常常搭配酯化剂使用。传统常用的有机溶剂有:DMSO、DMF、吡啶、甲苯、三乙胺、甲酰胺等［11］，下面介绍一些常用的硫酸酯化的方法。

1.1 N(SO3Na)3 法［10］

以及亚硫酸氢钠和亚硝酸钠合成的近似中性的醋化剂N(SO3Na)3在水溶液中与多糖反应由E.F.Paschall 于1956 年首次使用，N(SO3Na)3被证实是一种温和的硫酸酯化试剂，且发生的硫酸酯化反应相对不剧烈，引起的降解范围较小，同时低污染、低消耗，因而最近得到广泛关注。

1.2 氯磺酸-甲酰胺法［11，12］

氯磺酸-甲酰胺法是O’Neill，A.N.与1955 年首次使用的。主要步骤是将多糖悬浮于无水甲酰胺中，搅拌，在室温下逐渐加入酯化试剂氯磺酸，反应结束后，用NaOH 中和除氨，透析，浓缩，乙醇沉淀，沉淀经干燥即得。此方法是一种较为理想的硫酸酯化方法，但是被证实可能引起多糖的部分降解。

1.3 氯磺酸-吡啶法［13，14］

将附有冷凝管和搅拌装置的三颈瓶置盐水-冰浴中，加入吡啶，搅拌，使之充分冷却，用滴液漏斗慢慢加入一定量的氯磺酸，烧瓶中出现大量淡黄色固体，然后加入多糖粉末，迅速将三颈瓶移人沸水浴中，恒温搅拌1 h，冷至室温，将反应液倾入冰水中，中和后加入乙醇，析出沉淀，将沉淀溶于水透析72小时，过滤，滤液经冷冻干燥后得多糖硫酸化产物。该方法硫酸酯化试剂廉价易得，硫酸酯化效果较好。

1.4 其他方法

其他的硫酸酯化方法的方法还包括三氧化硫-吡啶法［15］、三氧化硫-三甲胺盐［16］，三氧化硫-DMF法［17，18］，浓硫酸法［19］等。

2 硫酸多糖的抗凝血活性

肝素是最早，也是已经比较广泛地用于临床的抗凝血剂［20］。但是研究显示:肝素在具有抗凝血活性的同时，会产生许多不可预见的副作用［21］，如:抗血小板活性，可引发不正常的流血现象［22，23］;以及由于动物源提取，人畜间朊病毒、疯牛病感染的几率增加等［24，25］。肝素在抗凝血作用与分子结构的特异性、硫酸基含量以及负电性有关［26］。近年来，根据肝素抗凝血机理制备得到的硫酸多糖由于其低副作用，传染疾病几率小等的特点而受到广泛的关注和研究。天然硫酸多糖和化学法硫酸化多糖都具有较好的抗凝血活性。

2.1 天然硫酸多糖

硫酸酯基及其负电性对抗凝血活性有着重要的影响，而海洋生物中的多糖含有丰富的硫酸酯基，是天然硫酸多糖最丰富最广泛的来源。含有天然硫酸多糖的海洋生物包括海洋植物中的藻类(红藻、褐藻、绿藻、水草)，海洋无脊椎动物中的海胆，海参，海鞘等。这些天然硫酸多糖抗凝血活性在过去的研究中都得到了不同程度的证明，海洋生物是抗凝血活性物质的良好来源［26，27］;海草中的一种硫酸多糖(SPSG)被证实也有良好的抗凝血活性［28］。APTT和PT 测试实验表明，SPSG 具有显著的抗凝血活性，且比试验肝素APTT 高2.5 倍，这个数据首次证明了从海草上提取的硫酸多糖的生物活性。霞水母提取物对小鼠抗凝血作用也有影响［29］，有研究显示，霞水母提取物能不同程度地延长小鼠体内凝血时间、出血时间和体外凝血时间，能显著提高小鼠的APTT 和PT。近几年来国内外同时也发现其他生物中含有天然硫酸多糖，实验证明其也具有良好的抗凝血活性。陈士国［30］等对海参硫酸软骨素和美国肉参进行了体外抗凝血活性分析。结果发现不同浓度的海参硫酸软骨素样品以及美国肉参均具有较强的抗凝血活性，两个样品的APTT 和TT 实验延长时间与标准肝素相近，且无非正常的流血现象。

肝素是被应用最早也是最广泛的抗凝血药物，但是普通肝素具有一定副作用，针对此，将天然肝素一定程度降解得到低分子量肝素近几年得到广泛的关注和研究。有研究对低分子量进行制备，且分离出高活性高纯度的低分子肝素，硫含量提高了0.828%［31］，抗凝血活性增强，因而减少用量，从而降低了副作用。水蛭中的也有抗凝血成分，提取结果发现正己烷、乙酸乙酯、水溶液提取部分均有不同程度的抗凝血药理活性，乙酸乙酯部分的抗凝血效果最强［32］。刺松藻多糖也能显著延长家兔血浆APTT、PT 和TT;显著抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的家兔血小板聚集［33］。

2.2 化学法硫酸化多糖

有些具有抗凝血活性的多糖，在脱去硫酸根以后，活性也随之消失或减弱。同时，也有些多糖因硫酸根的引入而明显增强了其抗凝血活性。一些不具有硫酸基团的多糖，如甲壳素，瓜尔豆胶，魔芋多糖等在修饰后具有较好的抗凝血效果。有实验表明，硫酸根对硫酸多糖生物活性的发挥起关键作用，尤其是抗凝血活性。

陈士国［34］等采用三氧化硫吡啶-二甲亚砜体系对北太平洋鱿鱼墨多糖(SIP)及其三乙胺盐进行硫酸酯化。研究表明:硫酸酯化对鱿鱼墨多糖的单糖组成影响不大，但是分子量降低，硫酸酯化后，糖单元数与硫酸基的摩尔比约为3∶2。凝血活性分析表明，它具有较好的延长活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)的效果。而对比未硫酸酯化过的鱿鱼墨多糖(不含硫酸基团)的无明显抗凝血活性，推断得出化学法硫酸化修饰成功增加了抗凝血活性。Lihong Fan［35］等通过N(SO3Na)3在水中与果胶多糖进行反应，对其进行硫酸酯化，取得了反应的最优条件(反应pH 为6，反应温度为60°C，反应时间12 h，亚硝酸钠和果胶的摩尔质量比为2.5/190mol/g)，并获得果胶硫酸酯。红外光谱，核磁共振证明硫酸基成功结合上，活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)实验证明样品有良好的抗凝血活性。对可食用的白树花真菌进行发酵，提取水溶性多糖，采用氯磺酸-吡啶法进行硫酸酯化修饰，可以获得水溶性的白树花多糖硫酸酯。APTT 、TT 以及凝血因子活性均说明白树花多糖硫酸酯具有明显的抗凝血活性，仅在5 mg/L 的浓度下即可发挥效果，在10 mg/L 浓度时，相当于150U 肝素的抗凝血效果［36］。

除了加入硫酸根基团，还有其他化学修饰的方法可以增加其抗凝血活性。宋玉民［37］等:以甲苯二异氰酸酯(TDI)中的-NCO 基与纳米金属氧化物表面的羟基发生反应，得到改性纳米金属氧化物，并使其与肝素钠进行接枝反应生成肝素杂化材料。肝素杂化材料的抗凝血时间和复钙时间均比肝素钠的要短，表明它的抗凝血性比肝素钠的抗凝血性要弱一些;但比纳米金属氧化物和空白组的抗凝血时间和复钙时间要长，说明肝素杂化材料的抗凝血性与其相比则有明显的提高。

3 硫酸多糖的构效关系

多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，多糖主链和支链的性质以及高级结构影响多糖的生物学活性。多糖的一级结构是指糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物的构型及糖链有无分支，分支位置与长短等。二级三级四级结构是建立在一级结构上，所形成的各种氢键、聚合体、空间结构等等。所以硫酸多糖构效关系的研究主要集中在糖基组成、糖基的连接方式以及糖基与硫酸基的连接方式上。

机体的自身的抗凝功能主要依靠的抗凝物质是丝氨酸蛋白酶抑制物，包括抗凝血酶III(AT-III)，和肝素辅因子(HC II)［38］，两者对凝血酶和凝血因子进行抑制，进而抑制凝血。多糖硫酸酯具有多负电荷特性，而AT-III 由于分子中存在赖氨酸和精氨酸残基，有高密度的正电荷，二者可以非特异性结合，从而激活AT-III，因此一定的阴离子电子密度对抗凝血作用非常重要［39］;而HC II 主要通过诱导凝血酶与之形成1:1 稳定复合物，从而使凝血酶失去蛋白水解酶活性，硫酸皮肤素的参与下，可催化加快速度。硫酸多糖的结构与相关凝血物质等的特异性结合导致了不同的抗凝血效果，因而研究硫酸多糖与凝血物质的构效关系，作用机理在近些年来得到国际上的广泛关注，成为研究的热点。

3.1 多糖的单糖组成及糖苷键类型

主链的糖单元组成、糖苷键类型直接决定多糖的活性，支链的类型、聚合度、在多糖链上的分布及其取代度决定多糖活性的强弱。有研究表明多糖的活性与α 或β 构型无关，与单糖种类无关，但与糖苷键的构型有关，邻近位置的硫酸基团也会导致构象发生变化［40］。对于(1～3)连接的多糖，6 位硫酸基的存在影响多糖的抗凝血活性，而对(1-4)连接的多糖硫酸基团的位置对多糖的活性却没有影响。Mao等［41］从一种绿藻提取到硫酸多糖，这种硫酸多糖基含量很高(主要是1，2 位连接的L-鼠李糖)，硫酸基团主要在C-3 和/或C-4 位，这与1991 年Maeda等［42］发现的M.nitidum 在组成上很相近，但是结构却有着截然的不同，主要是鼠李糖连接方式的不同。研究发现，这种新发现的硫酸多糖与M. nitidum 的抑制凝血因子并不相同，且凝血效果相差很大。

3.2 多糖分子量

根据研究报道，硫酸多糖的分子量是抑制凝血级联形成复杂的一个主要因素，对抗凝血活性有着重要影响［43］。低分子量肝素通过β 消除降解法从普通肝素中得到，经过对反应条件的优化，得到的低分子量肝素的分子量范围:分子量小于2000 的占17.5%，分子量大于8000 的占71.1%［31］。实验结果发现降解后的三种低分子量肝素与未修饰之前相比，IC50值分别降低了3.3、8.7 和2.4 倍，说明降解后，抗凝血活性大大增强了。然而一般情况下，对于硫酸多糖，分子量与抗凝效果呈正相关。然而，超高分子量可能限制硫酸果胶组分的扩散和吸收进入血液的过程。Thales R.Cipriani 等［43］对不同分子量的硫酸酯化果胶进行抗凝血活性的研究，结果表明，低分子量和高分子量的硫酸酯化果胶结构相似，都具有a (1→4)-linkedα-D-GalpA 结构，但高分子量硫酸酯化果胶的样品抗凝血效果更好，并且副作用更小。而Lihong Fan 等［35］在制备了不同分子量的硫酸酯化果胶多糖(分别为16、20、23 KDa)后测定了它们的抗凝血活性。结果发现分子量为20 KDa 的硫酸酯化多糖的抗凝血效果最好，分子量再增加，则效果出现降低。

沈元［44］采用近似中性的酯化剂三磺酸钠胺(N(SO3Na)3)与季铵化合物(QACS)反应，制备了季铵化合物硫酸酯(QACSS)。并对所得产物进行红外及核磁表征，证明了QACSS 的结构。出其分子量分别为1.40 ×104，2.51 ×104 和3.80 ×104。抗凝血活性实验结果表明，QACSS 的APPT，PT 及TT 值都高于正常值，说明QACSS 具有抗凝血活性;分子量为2.51 ×104 的QACSS 具有最好的抗凝血活性。

3.3 硫酸基含量及其取代度

硫酸基取代度的含义为每二糖单位中的硫酸基含量。实验表明，多糖硫酸酯的作用与其取代度在一定范围内呈正相关性。一般来说，硫酸根含量在每个糖残基平均1.5～2.0 时最佳，因而发生双硫取代反应对抗凝血活性的贡献较大。同时，硫酸根取代度仅仅是一方面，其他因素如取代位置和特定基团对抗凝血活性也有重要影响［45］。低分子量的褐藻多糖硫酸酯(50 KDa)兼具良好的抗凝血活性和更弱的血小板激活作用［46］。

Hatem Majdoub［47］通过聚氨酯泡沫超滤从螺旋藻培养基中提取的粗多糖组分并用DEAE-纤维素阴离子交换层析，得到多糖PUF1 和PUF2。测定硫酸根含量的结果表明PUF2 的硫酸根含量(20%)大于原粗螺旋藻培养基的胞外多糖(5%)，测定抗凝血活性的实验结果表明相比与PUF1 和原未提取的粗螺旋藻培养基的胞外多糖，PUF2 有很高的活性，甚至比硫酸皮肤素的抗凝血活性高。羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯通过羧甲基化、磺化等进行化学修饰后，抗凝血实验表明磺化取代度大于0.35 的羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯能拮抗内源性凝血途径，并且在一定范围内，羧甲基魔芋葡甘聚糖硫酸酯的抗凝血活性随着羧甲基取代度、磺化取代度和分子量的增加而增加［48］。

3.4 硫酸基的取代位置

不同来源的硫酸多糖抗凝血活性有很大的差别，这不仅在于多糖的种类不同，而且和硫酸基在多糖的取代位置有很大的关系。Mulloy 等［49］对硫酸软骨素通过核磁共振分析发现，保持硫酸基取代度不变，将硫酸软骨素B C-4 位上的硫酸基变为C-6位硫酸基，其抗凝血活性完全丧失，实验表明C-4 位上的硫酸基发挥着抗凝血作用。

Mourão PA.［50］在对褐藻的研究中发现2，4-二硫酸基团在抗血栓调节过程中有增强效果的作用。(从2-sulfated，3-linked α-L-fucans 到2，4-disulfated α-L-fucans 硫酸基含量增加了1.8 倍，活性却增加了38 倍);且特定的硫酸基结合位点决定了同血浆中丝氨酸蛋白酶抑制剂特异性结合。而单一的在3位连接α-L-岩藻糖位发生C-4 位硫酸根的修饰对肝素辅因子II 介导的凝血酶抑制非常重要，C-2 位硫酸根的修饰却有破坏抗凝血作用的性质。陈士国等［34］采用红外光谱和一维核磁技术对硫酸酯化后多糖的结构进行了分析，结果表明，硫酸酯化主要发生在N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的4、6 位上。进一步的抗凝血实验表明，样品的抗凝血效果很显著。Roberto［51］研究了过硫酸化的硫酸软骨素和岩藻糖基化的硫酸软骨素对凝血系统的作。结果发现过硫酸化的硫酸软骨素是在葡萄糖醛酸残基的2-和3-位发生硫酸化;同样，在半乳糖醛酸残基上的4-和6-位也发生了不同程度的硫酸化，其他硫酸基团被化学硫酸化反应结合上。而岩藻糖基化的硫酸软骨素由海参中提取，它的主干部分和硫酸软骨素很接近，支链部分还有2，4-二硫酸岩藻糖残基。岩藻糖基化的硫酸软骨素的凝血效果比过硫酸化的硫酸软骨素高很多，因而硫酸根的取代位置对其抗凝血活性有着重要的影响。

4 结论与展望

硫酸多糖的化学结构是其生物活性的基础。其广泛的来源和丰富的种类使其结构的研究成为研究的重点和热点。现在国内外对硫酸多糖的探索集中在两方面，一是寻找到新的，更广泛，效用更高，副作用更小的来源，同时也在寻找修饰效果更好副作用更小的硫酸酯化方法;一方面对抗凝血活性良好、来源广泛的硫酸多糖进行机理的进一步探索。国内外对硫酸多糖的结构和功能之间的构效关系的探索还在继续。硫酸多糖的作用位点、活性中心、介导物质、作用凝血因子及其可能带来一些凝血方面的副作用需要进一步的研究，这对更有重点和目的性地应用硫酸多糖带来技术支持。随着研究水平和技术的提高，更多深入、清楚的机理研究将为硫酸多糖的结构功能关系奠定更为深的基础，也为硫酸多糖的广泛应用提供更坚实的依据。

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