气相色谱－飞行时间质谱分析杭白菊浸剂挥发性化学成分

陈 玉，陆舍铭 ，朱 丽，孟昭宇，丁中涛

1红塔烟草集团有限责任公司技术中心，玉溪653100;2云南大学化学科学与工程学院分析化学，昆明650091

杭白菊(Hangzhou white chrysanthemum)，又名杭菊、甘菊、茶菊，是“浙八味”之一，素有“西湖龙井，杭白贡菊”之美誉。杭白菊既可食用、制作饮品，又是重要的中药材。《神农本草经》曾记载:菊花“久服利血气，轻身，耐老延年”。研究表明，杭白菊提取物中含有的姜黄烯、棕榈酸等物质可增强毛细血管抵抗力，降低血液中脂肪和胆固醇含量，具有改善心肌营养、抗炎、清除活性氧自由基等药理作用［1，2］;富含的酯类、烯类等使其具有独特的菊花香气，用于卷烟中能够改善和修饰卷烟烟气，有提高卷烟香气质量、改善余味、柔和烟气的作用，赋予烟丝一种自然风味［3-6］。

气相色谱-质谱联用的分析平台，由于其卓越的多功能性、高选择性，在早期的复杂样品成分分析中广泛应用。飞行时间质谱(TOFMS)较传统质谱具有灵敏度好、分析速度快、无需扫描等优势，且能推测分子和碎片离子的元素组成以辅助解谱，定性功能大大提高［7］。TOF MS 发展以来，已有不少前人应用于药物、天然产物等复杂样品的分析中，并以更快速、准确及可靠的特点得到肯定。

本实验采用GC-TOFMS 联用技术，以丙酸苯乙酯作为内标物质，根据内标物和杭白菊浸剂中挥发性化学成分的相对峰面积进行定量，分离效果良好，操作简单且准确度高。实验分析测定了杭白菊浸剂中挥发性化学成分33 种，利用飞行时间质谱所提供的具有精确质量特征碎片离子峰并参考谱图检索结果，确认了DL-苹果酸二乙酯的分子结构，并提出了裂解机理。

1 实验部分

1.1 主要仪器和装置

GC-TOFMS 联用仪(美国安捷伦公司Agilent 7890/美国Waters 公司GCT Premier);NIST 检索库(NIST MS Search 2.0);KQ-700DB 数控超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 主要材料和试剂

杭白菊浸剂样品(由红塔烟草集团提供，编号91428);二氯甲烷(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司);无水硫酸钠(化学纯，汕头市达濠精细化工品公司);丙酸苯乙酯标准品(日本东京化成工业株式会社)。

1.3 实验方法

1.3.1 内标萃取液的配制

选用丙酸苯乙酯作为内标物质。准确称取丙酸苯乙酯标准品0.1007 g，用二氯甲烷定容至100 mL作为内标储备液，该储备液再以二氯甲烷稀释成10.07 μg/mL 丙酸苯乙酯的内标萃取液。

1.3.2 样品前处理

准确称量杭白菊浸剂样品1.0 g 于锥形瓶中，加入二氯甲烷内标萃取液10 mL 及1.0 g 无水硫酸钠，于超声仪中超声30 min;静置5 min 后取上层清液，用0.45 μm 气相滤膜过滤取样于Agilent 气相色谱瓶中，准备进样。

1.3.3 仪器分析条件

气相条件:色谱柱:HP-5MS 毛细管柱(30 m ×0.25 mm × 0.25 μm);进样口温度:220 °C;载气:高纯He;进样量:1 (L;恒流模式;不分流;升温程序:起始温度50 °C，停留2 min，以每分钟5 °C 的升温速率升至220 °C 保持15 min。

TOFMS 条件:离子源:EI;电子能力:70 eV;离子源温度:220 °C;Trap 电流:100 μA;质量数范围:45～400 (m/z);溶剂延迟:0～6 min;采集时显示的谱图:总离子流色谱图(TIC);用全氟三丁基胺作内标，在m/z:218.9856 处作单点锁定校正精确质量。

2 结果与分析

2.1 实验结果

杭白菊浸剂样品经由GC-TOFMS 检测所得的总离子流图见图1;共分离出58 个峰，通过正反匹配度大于80 为依据，鉴定出33 个化学成分，并根据内标物和杭白菊浸剂中挥发性化学成分的相对峰面积，对各成分进行了定量。详情见表1。

图1 杭白菊浸膏GC-TOFMS 总离子图Fig.1 GC-TOFMS total ion chromatogram of Hangzhou white chrysanthemum extract

表1 杭白菊浸剂GC-TOFMS 分析结果汇总Table 1 Compounds identified in Hangzhou white Chrysanthemum extract by GC-TOFMS

苯乙酮(Acetophenone) C8H80 120.0573 16.137 84 17.5 2，2，4-trimethyl-1-cyclohex-3-enecarboxaldehyde C10H16O 152.1197 18.249 87 7.8 4H-Pyran-4-one，2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl－ C6H8O4 144.0420 18.52 89 82.1丁二酸单乙酯(Butanedioic acid，1-ethyl ester) C6H10O4 146.0576 19.269 97 60.2琥珀酸二乙酯(Diethyl succinate) C8H14O4 174.0888 19.357 87 68.7辛酸乙酯(Ethyl caprylate) C10H20O2 172.1458 19.848 95 28.4 5-羟甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural) C6H6O3 126.0315 21 93 179.5苯乙酸乙酯(Ethyl phenylacetate) C10H12O2 164.0834 21.396 87 7.7 DL-苹果酸二乙酯(Ethyl malate) C8H14O5 190.0837 21.983 95 231.6 DL-苹果酸(Malic acid) C4H6O5 134.0213 22.467 92 33.9芳-姜黄烯(Ar-curcumene) C15H22 202.1716 27.865 89 4.7 α-柏木烯(alpha-Cedrene) C15H14 194.1092 28.43 85 7.3(E)-1，1-二乙氧基-4-甲基-2-戊烯((E)-1，1-diethoxy-4-methyl-pent-2-ene) C10H20O2 172.1458 30.044 95 10.1金合欢醇(Farnesol) C15H26O 222.1977 32.486 92 76.1桉油烯醇(Espatulenol) C15H24O 220.1821 33.784 89 47.6安息香酸苄酯(Benzyl benzoate) C14H12O2 212.0834 34.665 92 16.2邻苯二甲酸二异丁酯(Diisobutyl phthalate) C16H22O4 278.1512 36.66 95 53.3棕榈酸(Palmitic acid) C16H32O2 256.2394 38.64 89 111.5棕榈酸乙酯(Ethyl palmitate) C18H36O2 284.2706 39.432 82 163.1 Benzoic acid，2-［(4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)methyl］－ C17H12O4 280.0732 43.936 91 29.8亚油酸乙酯(Ethyl linoleate) C20H36O2 308.2706 45.022 94 200.74亚麻酸乙酯(Ethyl linolenate) C20H34O2 306.2550 45.315 90 201.24

由表1 可以看出，杭白菊浸剂中挥发性化学成分主要是酯类、帖烯和倍半帖烯类、醛类和高级脂肪酸，主要成分有:DL-苹果酸及DL-苹果酸二乙酯、亚麻酸乙酯、亚麻酸酸乙酯、糠醛及5-羟甲基糠醛、棕榈酸、棕榈酸乙酯、邻苯二甲酸二异丁酯、丁二酸单乙酯、琥珀酸二乙酯、金合欢醇，占杭白菊浸剂挥发性化学成分的75%。

这些物质是构成杭白菊香味的重要物质，使其具有甜香香气、水果香气、烟草香气等香味特征［4］。其中亚油酸、亚麻酸等高级脂肪酸能改变烟气粗劣，使其具有淡甜柔和的吸味;酯类具有香脂气息和水果香味，可提高和改善烟香味、减轻刺激性;帖烯和倍半帖烯能够改进和提高烟草的自然风味，具有香味增效的作用［5］。还有很多物质具有一定的药理作用，如:苹果酸及其酯类衍生物具有特殊愉快的酸味，有较好的抗氧化能力，是良好的钾补充药，它能保持人体水分平衡，治疗水肿、高血压和脂肪积聚症等;姜黄烯具有清除自由基作用;安息香酸苄酯、桉油烯醇具有平喘、去痰作用;棕榈酸具有特殊的香味和滋味，有降低血清胆固醇的作用［6］;5-羟甲基糠醛具有抗氧化、保护肝组织、改善血液微循环等生物活性［8］等等。

2.2 分析讨论

实验发现了相关杭白菊成分分析的文献中未报道过的新物质DL-苹果酸二乙酯。在本实验总离子图的21.98 min 出现了精确质量为117.0562 的基峰，检索结果为DL-苹果酸二乙酯，匹配度为95。21.98 min 的色谱峰经扫描后得到飞行时间质谱图，DL-苹果酸二乙酯的色谱图及质谱图如下图2。

图2 DL-苹果酸二乙酯的色谱图及质谱图Fig.2 Chromatogram and mass spectrum of ethyl malate

对以上质谱图中m/z 117.0562 的基峰进行单元素分析，对应的元素组成分别为C5H9O3、C9H9，理论质量分别为m/z 117.0552、117.0704，以绝对误差最小为标准，选择与理论值(117.0552)的绝对误差仅1.0 mDa 的C5H9O3，这恰与DL-苹果酸二乙酯的特征离子相同。对质谱图进行全元素分析，以绝对误差小于6 mDa 来筛选分析结果，得到如下表2 质谱碎片离子的飞行时间质谱数据。观察表2 中5 个具有精确质量的特征碎片离子峰，精确质量的绝对误差均在±3 mDa 以内，这样的精确质量所对应的分子组成具有很高的可信度［7］。

表2 DL-苹果酸二乙酯的飞行时间质谱数据Table 2 TOFMS data of ethyl malate

DL-苹果酸二乙酯的裂解机理见图3。在70 eV电离条件下，DL-苹果酸二乙酯分子主要裂解成5 个特征碎片离子(表2)，具体裂解途径为:该分子在m/z 190.0828 处没有出现明显的分子离子峰，M 失去乙氧基得到阳离子a(m/z 145.0507，C6H9O4)，a失去羰基后生成自由基b(m/z 118. 0610，C5H10O3)。b 失去质子得到丰度为100%的阳离子c(m/z 117.0562， C5H9O3)，c 紧接着失去C2H4经过麦式重排得到阳离子d(m/z 89.0248，C3H5O3)，d 失去一个水分子经过重排，得到一个有明显质谱峰、较稳定的共轭体系阳离子e(m/z 71.0143，C3H3O2)。根据表2 的飞行时间质谱数据以及提出的裂解机理，能很好的确认DL-苹果酸二乙酯分子结构。根据与内标物质相对峰面积的方法，DL-苹果酸二乙酯含量为231.6 μg/g，占杭白菊浸剂挥发性化学成分的11.85%。

图3 DL-苹果酸二乙酯的飞行时间质谱裂解途径Fig.3 TOFMS fragmentation pathway of ethyl malate

3 结论

本实验采用GC-TOFMS 联用技术，根据TOFMS提供的分子离子峰和特征碎片离子峰，参考谱图检索结果确认化合物的分子结构。以丙酸苯乙酯作为内标物质，分离效果良好，依据内标物和杭白菊浸剂中挥发性化学成分的相对峰面积进行定量。测定了杭白菊浸剂中挥发性化学成分33 种，并对DL-苹果酸二乙酯的定性过程进行分析讨论，提出了裂解途径，确定其分子结构。

综上所述，采用TOFMS 进行定性，实验操作简单、准确度高，适合天然产物等复杂样品的成分分析和检测，在未来更深入的研究中有广阔的应用前景。

1 Jiang HD(蒋惠媂)，Xia Q(夏强)，Xu WH(徐万红)，et al.Chrysanthemum morifolium Ramat cardiovascular pharmacological effect and mechanism research progress. World Sci Technol Mod Tradit Chin Med (世界科学技术-中药现代化)，2002，4(2):31-33.

2 Zhang QH(张清华)，Zhang L(张玲).Research advance in chemical composition and pharmacological action of chrysanthemum.Food Drug (食品与药物)，2007，9(2):60-63.

3 Yan KY(闫克玉)，Yu J(于静)，Wang B(王冰). Extraction of essential oil in Hangzhou white chrysanthemum and its application in cigarette. Tobacco Sci Tech (烟草科技)，2008，1:34-42.

4 Xu Y(许永)，Xiang NJ(向能军)，Gao Q(高茜)，et al.Analysis of pyrolysis products of Hangzhou white chrysanthemum extract by gas chromatography-mass spectrometry. Fine Chem (精细化工)，2008，25:766-770.

5 Xu Y(许永)，Xiang NJ(向能军)，Shen HL(沈宏林)，et al.Analysis of volatile components of Hangzhou white chrysanthemum extract and applications in cigarette.Chin J Spectrosc Lab (光谱实验室)，2008，25:167-172.

6 Sun GJ(孙桂菊)，Zhang FF(张菲菲)，Ma YJ(马永建)，et al.Composition analysis of volatile oil extracted from chrysanthemum moriflium Ramat and determination of β -elemene.Food Sci (食品科学)，2008，29:506-510.

7 Hou KY(侯可勇)，Dong C(董璨)，Wang JD(王俊德)，et al.New developments and applications in time-of-flight mass spectrometer.Prog Chem (化学进展)，2007，19:385-392.

8 Lei P(雷鹏)，Li Y(李媛)，Li XZ(李新中)，et al.Comparison of gallic acid and 5-hydroxymethyl furfural between traditional slice decoction and dispensing granule decoction of Siwu Tang.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol (中药新药与临床药理)，2009，20:468-470.

9 Zhang GS(张国升)，Li QR(李前荣)，Yi H(尹浩)，et al.Rapid determination of ferulic acid and identification of its structure in rhizome of phragmites communis by GC-TOFMS.Chin Tradit Herb Drugs (中草药)，2005，36:333-335.

10 Sun XM(孙秀梅)，Zhang JX(张纪秀)，Zhang Q(张青)，et al. Characterization of phytohormones methoxime and TMS derivatives by gas chromatography time-of-flight mass spectrometry.J Chin Mass Spectrom Soc (质谱学报)，2009，30:110-113.