Micro-CT检测中等强度跑台运动对去卵巢大鼠腰椎微结构的影响

杨涵，卜淑敏，谢金珍，沈晶

(首都体育学院，北京 100191)

随着老年人口的急剧增加，绝经后骨质疏松已受到广泛重视并成为主要大众健康问题之一。骨质疏松是一种低骨量和微结构破坏的骨疾病，易导致骨强度减少，增加骨折危险［1］。虽然骨量是决定骨强度的主要因素，但有研究已表明，骨量仅能预测60% ～80%的骨强度，其余的骨强度是由骨计量学、松质骨的微结构和骨质量决定［2］。众多研究表明，体育运动能保持或增加人体和动物的骨量。事实上，在人类［3，4］，运动对绝经后妇女的骨密度有积极的效应。进一步，动物研究已证明［5-8］，运动对去卵巢大鼠的骨量、松质骨结构、骨强度也有积极的影响。然而，已有研究大部分是从骨几何学和形态计量学的角度，探讨运动对骨微结构的影响。与传统的骨组织形态计量学方法不同，Micro-CT 不仅不用破坏样品，而且能准确测量样品任意形态的结构参数，已初步用于临床检测药物对骨质疏松病人骨结构的治疗效果［9］。鉴此，本文采用Micro-CT 进行三维骨成像并测定骨小梁参数，评估了中等强度跑台运动对去卵巢大鼠腰椎微结构的影响，旨在为临床采用运动疗法预防绝经后骨质疏松提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物手术与分组

3月龄雌性SD 大鼠30 只，体重(225 ±8)g，由北京维通利华实验动物中心提供及饲养【SCXK(京)2011-0012】。自由饮水及进食，标准啮齿类动物饲料，适应性喂养1 周后，按体重随机分为假手术(Sham，10 只)和去卵巢手术(OVX，20 只)两组。手术前，两组大鼠均禁食12 ～18 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，手术组从背部切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，而将卵巢旁与卵巢等大的脂肪组织切除。无菌手术在北京大学医学部实验动物科学部进行［SYXK(京)2011-0039］，并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。术后自由进食水，1 周后按体重将手术组大鼠又随机分为去卵巢静止组(OVX，10 只)和去卵巢运动组(EX，10只)。实验过程中，去卵巢组2 只大鼠因腹部粘连而于术后不同时间死亡，最后纳入实验的各组大鼠的数目见表1。

1.2 运动训练方案

跑台运动训练方案参考前期报道并进行适当调整［10］。手术后第2 周，去卵巢运动组大鼠在小动物跑台上开始适应训练1 周，跑速是从第1 天的15 min 逐渐增加到第4 天的45 min。正式运动训练期为14 周，每周4 次，每次45 min，跑速为18 m/min，跑台坡度为5°。所有训练均在上午进行，各组大鼠同等条件饲养。每周称量各组大鼠体重1 次。

1.3 骨组织样品的收集

末次运动结束24 h 后，处死所有大鼠，处死前各组大鼠禁食12 h。腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取后，迅速游离子宫并称重以确定手术的成功。根据解剖位置截取第2，第3 和第4 腰椎，仔细剔除周围的软组织后，将第2和第3 腰椎用生理盐水浸泡过的湿纱布包裹后置于-40℃冰箱冻存;将第4 腰椎用4%多聚甲醛溶液固定后，置于-40°冰箱冻存1 周后进行micro-CT检测。

1.4 骨密度的检测

将第2 腰椎整齐摆放在XR-36 Norland 型双能X 射线骨密度仪的吸收测量平台上，在小动物模式下，扫描第2 腰椎的骨密度。

1.5 micro-CT 分析及三维结构重建

采用三样本同时扫描的方法，用Micro-CT(225 V)扫描仪对第4 腰椎进行扫描。将三样本放入底座为平底的圆形塑料管中，确保三样本摆放方向相同且在同一水平面上。扫描层间距为12 μm，分辨率为12.5 μm，电压为80 kV，电流为0.18 mA，功率为9 W，扫描角度为14400，每秒1 帧，每个样本获得1536 幅图片进行三维重建。胫骨近端三维重建划分感兴趣区域为干骺端生长板下6 mm 处，在二维图像中专门划分胫骨感兴趣区域:长1.6 mm，宽1.02 mm，高6.1 mm;椎骨感兴趣区域:高0.9 mm，宽1.9 mm，长4.8 mm。

1.6 椎体压缩实验

将第3 腰椎置于WD-4020 电子万能实验机上，调整压头接近腰椎骨，跨度为10 cm，以每分钟1 mm 的加载速度进行压缩，腰椎骨出现塌陷或压缩性骨折时停止压缩，用仪器自带的绘图仪自动描记出载荷一变形曲线。测定指标有:最大载荷、最大应力、弹性模量和吸收能量。

1.7 统计学处理

实验数据采用SPSS 16.0 软件进行统计，结果以均值±标准差表示，进行单因素方差分析。P ＜0.05 为差异具有显著性。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度和生物力学测定结果

实验结束时，去卵巢静止组第2 腰椎骨密度显著低于假手术组，而去卵巢运动组大鼠第2 腰椎骨密度显著高于去卵巢静止组。结果见表1。

实验结束时，去卵巢静止组大鼠第3 腰椎最大载荷、最大应力和弹性模量显著低于假手术组，而去卵巢运动组大鼠第3 腰椎最大载荷、最大应力和弹性模量显著高于去卵巢静止组。结果见表1。

表1 各组大鼠腰椎骨密度和生物力学性能指标的比较(±s)Tab.1 Comparison of the lumbar bone mineral density and biomechanical properties

表1 各组大鼠腰椎骨密度和生物力学性能指标的比较(±s)Tab.1 Comparison of the lumbar bone mineral density and biomechanical properties

注:与假手术组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与去卵巢静止组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note:Compared with the sham group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with the OVX group，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

组别Groups n 骨密度/g/cm2 BMD最大载荷/N Max.load最大应力/N/mm2 Max.stress弹性模量/N/mm2 Elastic modulus假手术组Sham 10 0.223 ±0.016 530.800 ±50.902 23.262 ±3.916 308.921 ±56.698去卵巢静止组OVX 9 0.173 ±0.009＊＊ 438.628 ±67.241＊＊ 7.956 ±3.381＊＊ 218.751 ±43.056＊＊去卵巢运动组EX 9 0.208 ±0.010# 512.942 ±63.458## 21.875 ±2.689# 289.382 ±60.221##

2.2 各组大鼠micro-CT 分析及三维结构重建结果

实验结束时，去卵巢静止组骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)显著低于假手术组，而骨小梁分离度(Tb.Sp)显著高于假手术组;去卵巢运动组BV/TV 和Tb.N 显著高于去卵巢静止组，Tb.Sp 显著底于去卵巢静止组，而Tb.Th 差异无显著性。结果见表2。

micro-CT 三维图像重建结果显示，与假手术组比较，去卵巢静止组骨小梁稀疏，局部有较大的骨小梁空隙形成;与去卵巢静止组比较，去卵巢运动组骨小梁数目增加，骨小梁空隙减少。结果见图1。

表2 各组大鼠腰椎结构参数的比较(±s)Tab.2 Comparison of the lumbar structural parameters

表2 各组大鼠腰椎结构参数的比较(±s)Tab.2 Comparison of the lumbar structural parameters

注:与假手术组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与去卵巢静止组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note:Compared with the sham group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;compared with the OVX group，#P ＜0.05.

组别Groups n BV/TV/% Tb.N#/mm Tb.Th/mm Tb.Sp/mm假手术组Sham 10 57.05 ±5.51 4.76 ±0.09 120.12 ±12.59 90.10 ±11.26去卵巢静止组OVX 9 30.49 ±6.04* 3.63 ±0.47 79.47 ±7.72* 161.83 ±11.41＊＊去卵巢运动组EX 9 42.06 ±4.76# 4.23 ±0.23# 80.67 ±9.47 126.55 ±23.07#

图1 各组大鼠第4 腰椎micro-CT 三维结构重建图Fig.1 Three-dimensional reconstruction of trabecular bone from the fourth lumbar vertebra

3 讨论

大鼠去卵巢后，骨质疏松的病理改变主要发生在松质骨。松质骨的代谢比皮质骨要快，而且对治疗的反应也比皮质骨早。腰椎松质骨含量多且较均匀，形态变异小，影像学定位准确，测量该部的敏感度高，准确率好，常用于监测骨量和骨结构的变化［11］。适当的耐力运动能减缓绝经后妇女或去卵巢动物骨量的丢失。本实验中，去卵巢大鼠经过为期14 周的中等强度跑台运动处理后，腰椎骨密度显著高于去卵巢静止大鼠的。此结果与我们前期报道的结果相似［10］。

骨组织形态计量学是传统的观察骨微结构变化的常用方法。骨组织形态计量学是采用组织学方法先获得组织切片，进而获得二维图像，然后计算出相关数据。1989年，Micro-CT 技术首次被采用对骨结构进行研究［12］，近几年已得到发展和成熟。micro-CT 三维技术不仅不需破坏骨材料，而且能更好地观察骨松质骨三维空间结构的变化。就我们查阅文献所知，本文在国内外首次通过Micro-CT 技术扫描第4 腰椎，获得其二维图像后重建三维图像，从立体角度研究跑台运动对去卵巢大鼠松质骨微结构的影响。结果表明，假手术组大鼠骨小梁排列均匀紧密，骨小梁数目密集、分布均匀、有较好的连续性、骨小梁间隙狭窄、形状各异;而去卵巢静止组大鼠骨小梁数目明显减少，骨小梁分离度增加，局部有较大的骨小梁空隙形成。通过14 周的中等强度跑台运动干预后发现，骨小梁数目较去卵巢静止组有显著的增加，其间隙减少。此结果与Iwamoto 等［7］用骨组织形态计量学获得的实验结果一致。提示，Micro-CT可用于评价运动干预手段对去卵巢大鼠松质骨微结构的影响。此外，本实验中，去卵巢大鼠经过跑台运动处理后，骨小梁数目有显著变化，而厚度并没有显著变化。提示，跑台运动是通过抑制去卵巢大鼠骨小梁数量的减少来减缓去卵巢大鼠骨量的丢失。

骨微结构的改变能直接影响骨的生物力学性能。松质骨的力学性能不仅依赖骨的数量而且依赖他的微结构。因此，通过获得的骨微结构参数结合力学检测能更合理地评价骨质疏松及抗骨质疏松疗效效果。本实验的生物力学结果表明，去卵巢大鼠最大载荷、最大应力均显著低于去卵巢运动组的。提示跑台运动能通过减缓去卵巢大鼠骨小梁数量的丢失而保持去卵巢大鼠的生物力学性能。

［1］Brandão CM，Machado GP，Acurcio FD.Pharmacoeconomic analysis of strategies to treat postmenopausal osteoporosis:a systematic review.Rev Bras Reumatol［J］.2012，52(6):924 -937.

［2］范慧洁，戴如春，盛志峰，等.去卵巢大鼠不同时期皮质骨与松质骨变化的显微CT 观察［J］.中华老年医学杂志，2008，27(1):57 -61.

［3］Gómez-Cabello A，Ara I，González-Agüero A，et al.Effects of training on bone mass in older adults:a systematic review［J］.Sports Med，2012，42 (4):301 -325.

［4］Herrmann D，Hebestreit A，Ahrens W.［Impact of physical activity and exercise on bone health in the life course:a review］［J］.Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz.2012，55 (1):35 -54.

［5］Barengolts EI，Barengolts EI，Curry DJ，et al.Effects of endurance exercise on bone mass and mechanical properties in intact and ovariectomized rats［J］.J Bone Miner Res.1993，8(8):937 -942.

［6］Simões PA，Zamarioli A，Blóes P，et al.Effect of treadmill exercise on lumbar vertebrae in ovariectomized rats:anthropometrical and mechanical analyses［J］.Acta Bioeng Biomech，2008，10(2):39 -41.

［7］Iwamoto J，Takeda T，Ichimura S.Effects of moderate intensity exercise on tibial bone mass in mature ovariectomized rats:bone histomorphometry study［J］.Keio J Med.1998，47 (3):162 -167.

［8］Peng ZQ，Väänänen HK，Tuukkanen J.Ovariectomy-induced bone loss can be affected by different intensities of treadmill running［J］.Calcif Tissue Int.1997，60 (5):441 -448.

［9］Bock O，Börst H，Beller G，et al.Impact of oral ibandronate 150 mg once monthly on bone structure and density in post-menopausal osteoporosis or osteopenia derived from in vivo μCT［J］.Bone，2012，50 (1):317 -324.

［10］Bu S，Chen Y，Wang S，et al.Treadmill training regulates βcatenin signaling through phosphorylation of GSK-3β in lumbar vertebrae of ovariectomized rats［J］.Eur J Appl Physiol.2012，112 (9):3295 -304.

［11］Yoon KH，Cho DC，Yu SH，et al.The change of bone metabolism in ovariectomized rats.analyses of microCT scan and biochemical markers of bone turnover［J］.J Korean Neurosurg Soc，2012，51(6):323 -327.

［12］Liu YX.［CT myelography with low concentration and/or a low dose of nonionic contrast water-soluble medium］.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，1989，27.