地榆鞣质的制备及其对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症影响的初步研究

杨金辉，杨明，黄晶，张薷云

地榆鞣质的制备及其对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症影响的初步研究

杨金辉，杨明，黄晶，张薷云

目的 制备地榆鞣质提取物，观察其对白细胞减少症的影响。

方法 采用明胶沉淀丙酮解析法制备地榆鞣质提取物。选用KM 小鼠，按体重和性别随机分成空白组、模型组、阳性组（rhG-CSF 组）和地榆鞣质高、中、低剂量（20、10、5 mg/kg）组，用环磷酰胺复制小鼠白细胞减少症模型，并以白细胞数（WBC）、脾脏系数和骨髓 DNA 含量作为检测指标，研究地榆鞣质的升白作用。

结果 所制地榆鞣质纯度达 90%；药理研究显示，地榆鞣质高、中、低剂量组均能显著升高白细胞数量（P ＜ 0.05），且地榆鞣质高、中剂量组升高骨髓 DNA 的作用优于阳性药（rhG-CSF）组。

结论 采用明胶沉淀丙酮解析制备法可获得纯度较高的鞣质部位，鞣质具有显著的升高白细胞及保护骨髓 DNA 的作用。

地榆属； 白细胞减少； 鞣质

地榆，始载于《神农本草经》，为蔷薇科植物地榆 Sanguisorba officinalis L.或长叶地榆 Sanguisorba officinalis L.var.longifolia (Bert.) Yü et Li 的干燥根，味苦、酸、涩，性微寒，归肝、大肠经，具有解毒敛疮、凉血止血的功效。地榆含有多种化学成分，其中含量较多的有鞣质与酚酸类、三萜及皂苷类、黄酮类等[1-2]。现代研究表明地榆有止血、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、镇吐、止泻、治疗烧烫伤、抗溃疡及增强免疫功能等功效[3-4]。地榆鞣质用于出血、溃疡、创伤、灼伤等由来已久，但用于升高白细胞的研究却鲜有报道。

本文拟以明胶沉淀丙酮解析法制备地榆鞣质，并研究其对环磷酰胺致小鼠白细胞减少症的治疗作用，为临床研究开发具有升白保髓双重功效的中药制剂提供药理学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 地榆，批号：101205，购自四川科伦天然药业有限公司，经成都中医药大学药学院生药教研室卢先明教授鉴定为蔷薇科植物地榆的干燥根。

1.1.2 动物 KM 小鼠，SPF 级，雌雄各半，18 ～22 g，购自成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK（川）2004-15。

1.1.3 设备 UV-1700 型紫外分光光度计购自日本岛津公司；RE2000B 旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂；ALPHAi-4LSC 冷冻干燥机购自德国Christ 公司；BP211D 电子分析天平（十万分之一）购自德国 Sartorius 公司；MEK-6318 全自动血球计数仪购自日本光电工业株式会社；酶标仪购自美国赛默飞世尔公司。

1.1.4 试剂及药品 没食子酸标准品，批号：110831-200803，购于中国药品生物制品检定所；明胶、乙酸乙酯、丙酮均为分析纯；注射用环磷酰胺，批号：10051521，为江苏恒瑞医药股份有限公司产品；重组人粒细胞集落刺激因子注射剂（rhG-CSF），规格：75 μg，批号：201007YA05，为华北制药金坦生物技术股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 地榆鞣质提取物制备 取药材 200 g，粉碎成粗颗粒，加 10 倍量 70% 丙酮，超声提取 2 次，每次 1 h，过滤提取液，滤液 45 ℃ 减压回收丙酮至完全，得浓缩液 A；将 A 加水后放置 1 h，过滤去沉淀，滤液用水饱和乙酸乙酯萃取 2 次，收集萃取液，45 ℃ 减压回收乙酸乙酯至完全，得浓缩液 B；将 B 置 45 ℃ 水浴挥干溶剂，45 ℃ 真空干燥，即得粗品鞣质。取上述粗品鞣质，加水溶解，静置后过滤去沉淀，滤液置于蒸发皿中，缓慢喷入明胶溶液，静置，待沉淀完全后，收集沉淀，冷冻干燥 12 h 后取出，研磨成细粉，用 90% 丙酮超声提取 2 h，药液于 45 ℃ 减压回收至完全，倾出浓缩液，45 ℃ 真空干燥，即得纯化鞣质。

1.2.2 含量测定 参考《中国药典》2010年版一部附录 XB 鞣质含量测定项下方法制备。

⑴对照品溶液的制备：称取没食子酸对照品48.30 mg，置 100 ml 棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，量取 5 ml，置 50 ml 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（每 1 ml 中含没食子酸 0.0483 mg）。

⑵标准曲线的制备：精密量取对照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置 25 ml 棕色容量瓶中，各加入磷钼钨酸试液 1 ml，再分别加水11.5、11、10、9、8、7 ml，用 29% 碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置 30 min，以相应的试剂为空白，参照《中国药典》2010年版一部附录 VA 紫外-可见光光度法，在 760 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

⑶供试品溶液的制备：取 3 份纯化鞣质，各0.1 g，精密称定，置 250 ml 棕色容量瓶中，加水150 ml，放置过夜，超声处理 10 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，弃去初滤液，取续滤液 20 ml，置 100 ml 棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

⑷鞣质含量测定

总酚：量取供试品溶液 2 ml，置 25 ml 棕色容量瓶中，参照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液 1 ml”起，加水 10 ml，依法测定吸光度，从标准曲线读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），样品中总酚含量以没食子酸计。

不被吸附的多酚：精密量取供试品溶液 25 ml，加至已盛有干酪素 0.6 g 的 100 ml 具塞锥形瓶中，密塞，置 30 ℃ 水浴中保温 1 h，时时振摇，取出，放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液 2 ml，置 25 ml 棕色容量瓶中，参照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钨酸试液 1 ml”起，加水 10 ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量（mg），计算，即得。

按下式计算鞣质的含量：鞣质含量 = 总酚量 － 不被吸附的多酚量。

1.2.3 鞣质部位对白细胞减少症的影响

1.2.3.1 样品溶液配制 取上述鞣质纯品，加水溶解配制成总鞣质浓度为 1 mg/ml 的溶液，依次稀释制成总鞣质浓度为 0.5、0.25 mg/ml 的溶液，即得高、中、低浓度样品溶液。

1.2.3.2 实验分组及给药 动物适应性喂养 3 d后，按体重随机分为 5 组，每组 10 只，分为：①模型组：等体积纯净水；②阳性对照组（rhGCSF）：皮下注射 30 μg/(kg·d)；③～⑤地榆鞣质高、中、低剂量组：20、10、5 mg/kg，另取 10 只正常小鼠作为空白对照组⑥。除阳性组，其余各组小鼠按体重、剂量灌胃给予药物或纯净水，连续 7 d。1.2.3.3 模型复制 第 8 天空白组腹腔注射给予等体积生理盐水外，其余各组按小鼠当日体重腹腔注射环磷酰胺 80 mg/(kg·d)，连续 3 d。除阳性组外，从造模当日起继续灌胃给药 6 d。阳性组造模结束后开始连续皮下注射 rhG-CSF 3 d。1.2.3.4 指标检测及方法

白细胞（WBC）数目测定：造模结束后第 4 天，毛细管眼眶采血 20 μl，用加有 2 ml 稀释剂和50 μl 1% 的肝素钠溶液稀释后，采用全自动血球计数仪检测外周血白细胞数目。

脾脏系数计算：脱颈椎处死动物，解剖取脾脏称重，计算脾脏重量系数。

脾脏重量系数 = 脾脏重量/体重 × 100%

骨髓 DNA 含量测定[5]：剖取左侧完整股骨，用医用纱布除净软组织，用 0.005 mol/L CaCl210 ml将全部骨髓冲入试管中，置 4 ℃ 冰箱 30 min，2500 r/min 离心 15 min，弃去上清，将沉淀物加0.2 mol/L HClO45 ml 充分混匀，90 ℃ 水浴加热15 min，放冷后 3500 r/min 离心 10 min，取上清，用酶标仪于 260 nm 波长处测定 OD 值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 地榆鞣质含量测定结果

2.1.1 鞣质含量标准曲线 地榆鞣质含量测定标准曲线及线性范围结果见图 1 和表 1。

回归方程为：Y = 0.1181X + 0.0465，r2=0.9998，表明地榆鞣质在 0.966 ～ 9.660 μg/ml 浓度范围内线性关系良好。

表 1 地榆鞣质含量测定线性和范围Figure 1 Burnet tannin content determination of linearity and range

2.1.2 鞣质含量测定结果 以没食子酸计，地榆总鞣质含量测定结果见表 2。

2.2 地榆鞣质升白作用结果

由表 3 可知，与空白组比较，模型组小鼠外周血白细胞数目、脾脏系数和骨髓 DNA 含量均显著降低（P ＜ 0.05）。与模型组比较，地榆鞣质高、中、低剂量组均可显著升高白细胞数量（P ＜ 0.05），地榆鞣质高、中剂量组均可显著提高脾脏系数（P ＜0.05）和骨髓 DNA 含量（P ＜ 0.05）。rhG-CSF 对WBC、脾脏系数也起到明显作用（P ＜ 0.05），但对骨髓 DNA 含量反而起到反作用；由此可见，地榆鞣质具有明显的升高 WBC 和保护骨髓的作用，且在保护骨髓 DNA 方面，地榆鞣质的效果优于rhG-CSF。

图 1 地榆鞣质含量测定标准曲线Figure 1 Burnet tannin content determination standard curve

3 讨论

本文鞣质的制备过程采用了“丙酮提取、乙酸乙酯萃取、明胶沉淀和丙酮解析”的基本原理。在制备过程中提取温度不宜过高，温度过高易造成鞣质缩合；药液应控制在适宜的浓度范围，防止在絮凝过程中因浓度过高造成包裹进入其他杂质；沉淀鞣质时，明胶的用量控制在使药液呈蛋清状即可；此外，要严格控制解析温度，否则加热会使明胶沉淀物粉末发生软化、聚集，将鞣质包裹在内难以解析，采用超声最佳，并注意换水。

鞣质含量测定时，因磷钼钨酸钠试液配置流程繁琐，操作易失误，故而在配置该试液时一定要严格按照药典要求，此外，该试液放置一段时间会变成绿色，需要加入 0.2 ml 溴，并煮沸 15 min，放冷，加水定溶至煮沸前体积，待变为黄色方可使用。

表 2 地榆鞣质含量测定结果Table 2 Burnet total tannin content determination results

表 3 地榆鞣质升白作用结果（±s ，n = 10）Table 3 Results of Burnet tannin elevating WBC effect (±s , n = 10)

表 3 地榆鞣质升白作用结果（±s ，n = 10）Table 3 Results of Burnet tannin elevating WBC effect (±s , n = 10)

注：与模型组比 *P ＜ 0.05。Notes: Compared with the model group *P ＜ 0.05.

组别Groups白细胞（109/L）WBC (109/L)脾脏重量系数（mg/10g）Spleen weight coefficient (mg/10g)骨髓 DNA 含量（μg）Bone marrow DNA content (μg)空白 Blank 6.18 ± 0.44 32.18 ± 4.01 121.87 ± 8.11模型 Model 2.24 ± 0.29 19.56 ± 2.99 67.85 ± 5.63阳性 Positive（rhG-CSF） 6.75 ± 0.46* 30.90 ± 4.20* 56.29 ± 3.67低剂量 Low dose 3.97 ± 0.39* 24.16 ± 3.01 87.22 ± 3.26中剂量 Middle dose 4.55 ± 0.47* 26.86 ± 4.23* 94.28 ± 7.98*高剂量 High dose 4.92 ± 0.74* 28.44 ± 4.20* 116.32 ± 8.93*

环磷酰胺作为双功能烷化剂，能够非特异性的作用于细胞周期，干扰 DNA 和 RNA 的功能，其强烈的烷化作用能与 DNA 发生交叉联结，从而抑制 DNA 的合成。骨髓是重要的造血器官，小鼠腹腔注射环磷酰胺后，骨髓造血细胞 DNA 合成被抑制，造成生血不足，连续大剂量给予环磷酰胺可造成骨髓造血抑制，白细胞生成不足，从而形成白细胞减少症。课题组在前期对造模方法进行了预试优化，按动物当日体重给予环磷酰胺 80 mg/(kg·d)，连续腹腔注射 3 d，于造模给药后的第 4 天取血检测，发现白细胞减少了约 2/3。给予地榆鞣质后，在短时间内（约 72 h），白细胞迅速升高，约可升高到原来的 80%，表明该方法可行。

rhG-CSF 能够通过刺激骨髓多功能造血干细胞，促进其分化、成熟、释放，从而在短时间内达到快速升白的效果，防止由于患者免疫力低下造成一系列的并发症。但由于环磷酰胺对骨髓造血功能的破坏作用，骨髓造血功能本身受到抑制，加上rhG-CSF“饮鸩止渴”式的治疗作用，会使患者生血功能越发衰弱。相对于 rhG-CSF 单纯的升白作用，地榆鞣质对环磷酰胺所致的骨髓 DNA 含量减少也有显著保护作用（P ＜ 0.05），从而从根本上改善了白细胞减少的症状，且其升白效果呈现量效关系，具有“标本兼治”的作用。

临床研究表明，地榆升白片对于放疗患者白细胞减少症具有明显的预防作用[6]，其对白细胞减少症的治疗作用也收到了明显的临床效果[7-8]。高小平等[9]通过体外培养小鼠骨髓造血细胞及在体实验研究发现地榆升白的主要有效部位是地榆皂苷，且主要升高小鼠骨髓有核细胞和外周血白细胞、红细胞及血小板的数量；系对外周血象整体都有改善作用。笔者研究结果表明地榆鞣质主要能显著升高白细胞数量和骨髓 DNA 含量，且对脾体重系数也有升高作用；系对白细胞特异性的升高作用，此外前期研究结果表明，地榆鞣质对外周血红细胞、血小板及血红蛋白含量影响较小，无显著的改善作用。

因此，地榆鞣质作为一种能稳定、快速升高白细胞并兼具骨髓造血保护作用的化学物质，极具市场前景和科研价值。笔者拟就地榆鞣质的升白作用做进一步的研究，以期奠定其升白的物质基础。

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Preparation of Burnet tannins and preliminary study of its influence on Leukopenia in mice induced by cyclophosphamide

YANG Jin-hui, YANG Ming, HUANG Jing, ZHANG Ru-yun

ObjectiveTo prepare Burnet tannins extracts and observe its influence on Leukopenia.

MethodsGelatin precipitation and acetone resolution methods were used to prepare Burnet tannins extracts.Mice of KM species were randomly classified into blank group, model group, positive group (rhG-CSF), and high, middle and low dosage (20, 10, 5 mg/kg) of tannins group, according to weight and gender.The leucopenia mice model was made by cyclophosphamide treatment, and white blood cells (WBC) number, spleen index and bone marrow DNA content were measured to test tannins’ effect on the WBC.

ResultsThe purity of Burnet tannins extracts by this method reached about 90%.Pharmacological studies showed that WBC numbers in all of the three tannins groups can significantly be elevated (P ＜ 0.05), and bone marrow DNA contents in tannins group of high and middle dosage (20 mg/kg, 10 mg/kg) are better than that in rhG-CSF group.

ConclusionsHigher purity of Burnet tannins can be extracted by method of gelatin precipitation and acetone resolution, and the Burnet tannins can significantly elevate WBC and protect bone marrow DNA.

Sanguisorba; Leukopenia; Tannins

YANG Ming, Email:Yangming16@126.com

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2013, 8(1):41-45

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.01.009

611137 成都中医药大学药学院（杨金辉、黄晶、张薷云）；330004 南昌，江西中医学院（杨明）

杨明，Email：Yangming16@126.com

2012-10-22

Author Affiliations: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China (YANG Jin-hui, HUANG Jing,ZHANG Ru-yun); Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

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