轴突导向因子与疼痛之间关系的研究进展

吕正涛 牟子君 李 熳

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院第二临床学院，湖北武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院神经生物学系，湖北武汉 430030

轴突导向因子主要在神经系统发育过程中起化学趋化及导向作用，同时还作用于免疫系统、心血管系统，并与肿瘤的形成、新血管的生长密切相关。目前已经发现了4个轴突导向因子家族：Semaphorins，Slits，Netrins 和 Ephrins。近些年，越来越多的研究表明，部分轴突导向因子与成年后的疼痛密切相关，主要包括神经病理性痛、癌性痛、炎性痛。本文将对轴突导向因子参与疼痛发生的机制进行综述，希望有助于对各类型疼痛进行更合理的治疗。

1 Semaphorins

1.1 Semaphorins的结构及作用

Semaphorins是一类重要的轴突导向因子，在神经系统的发育过程中对神经元及胶质细胞发挥重要导向作用。1992年，Kolodkin等发现了第一个Semaphorin家族成员——Sema21a（原称为 Semaphorin1，简称为 Sema-1）。Semaphorin（简称Sema）家族包含至少20个成员，其在N端都有一个相似的Sema结构域。按照种系发生和结构特征可将Semas分为8类，其中5类在脊椎动物里有表达：Sema3A～Sema3F，Sema4A～Sema4G，Sema5A～Sema5B，Sema6A～Sema6C，Sema7A，受体主要为 neuropilins和 plexins[1]。 随着研究不断深入，发现这类因子不仅可以影响轴突的生长，还在调节细胞黏附、增殖、迁移及形态变化、肿瘤生长转移、参与机体免疫反应及新生血管形成的过程中都具有重要的作用[2-4]。近年来，越来越多的研究表明Semas与疼痛的发生密切相关。

1.2 Semaphorins与疼痛

2009年Cheung等[5]对1043名志愿者进行核磁共振成像观察，发现大约40%的慢性非特异性腰背痛由椎间盘的退行性病变引起。正常成年人的椎间盘（interbertibral disc，IVD）几乎没有神经分布及血管生长，只有纤维外环的细胞有少量神经分布和血管长入[6]。健康成年人的椎间盘内有大量 Semaphorin3A（Sema3A）表达，实验发现，伴随 Sema3A表达的降低，有新生血管及神经纤维长入椎间盘，说明Sema3A的低表达降低了对神经和血管生长的抑制作用，引起感觉神经及血管的长入。纤维外环细胞中，Sema3A的高表达，可能是阻止神经长入的机制之一[7]。

脊髓损伤之后有大量的感觉神经纤维向脊髓中再生，这是可以通过实验测得的，但是没有证据显示这种再生是靶向再生。在脊髓损伤后，神经纤维的非靶向再生可能导致异位神经纤维再生，这种异位神经再生可以导致神经功能障碍，例如慢性疼痛。Tang等[8]发现，大鼠行神经根切断术后，神经生长因子（neuron growth factor，NGF）在脊髓中的超表达介导了降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide positive，CGRP）阳性的感觉神经纤维在背角及腹角长芽、再生，而这种异位再生导致了慢性疼痛。在脊髓背角和腹角接种腺病毒，诱导Sema3A表达，限制了神经纤维向脊髓Ⅰ层、Ⅱ层长芽，引导神经纤维的靶向再生；当NGF和Sema3A联合应用时，受损的脊髓恢复了正常构型并且没有发生疼痛。Sema3A是一种重要的化学排斥物，可以介导生长锥的塌陷。而Wanigasekara等[9]发现，用NGF、神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line–derived neurotrophic factor，GDNF）或 neurturin（NTN）预处理的成熟神经元中没有出现Sema3A导致的生长锥坍塌这一变化。还有研究表明，Sema3A可以抑制较低浓度的NGF诱导的伤害性传入纤维长芽，但不能抑制高浓度NGF的诱导作用[10]。笔者认为，NGF作为神经营养因子，在神经损伤后引起神经纤维的大量再生，但是这种再生是非靶向的，甚至是异位的；而Sema3A作为神经生长的排斥性因子，可以阻止异位神经纤维的生长，恢复神经纤维生理性的分布。通过NGF和SemaA的相互作用，引导神经纤维靶向再生，这可以指导神经损伤的治疗，解决长期的慢性疼痛。

神经病理性痛（neuropathic pain，NP）又称神经痛，是一种慢性疼痛状态，主要分为自发性疼痛（spontaneous pain）、痛觉超敏（allodynia）和痛觉过敏（hyperalgesia），常用镇痛药物治疗后疗效不佳，是临床亟待解决的难题，神经病理性痛发生在神经损伤或神经疾病状态，如糖尿病、癌症、感染、自身免疫性疾病以及创伤[11]。新近研究表明，轴突导向因子参与了神经病理性痛的病理生理过程。神经损伤后轴突导向因子可以影响突触可塑性，这对神经病理性痛的诱发与维持至关重要。Hayashi等[12]发现，在慢性压迫性神经损伤（chronic constriction injury，CCI）导致的大鼠神经痛模型中，背角Neurophilin1（NP1）表达增加，而且CCI模型中，鞘内注射重组Sema3A可以减少机械痛超敏和热痛过敏，但鞘内注射热灭活的Sema3A没有这种作用。NP1和PlexinA1都是Sema3A的受体，NP1和plexinA1结合成复合受体。Sema3A与NP1、plexinA1组成的复合受体结合后，plexinA1胞内段变形，其中间机制尚不清楚，但最终可以通过肌动蛋白解聚因子（cofilin）去磷酸化引起肌动蛋白活性改变，导致生长锥的塌陷，减少神经纤维的异位再生。

2 Slits

2.1 Slits的结构及作用

Slit是一种分泌型蛋白，主要表达在中枢和周围神经系统，其有三种亚型 ：Slit1、Slit2、Slit3。 Slits 与 其 受 体Roundabout（Robo）作用后，通过调节细胞内 Rho GTPase（主要包括 Rac1，Cdc42，RhoA）的活性，产生轴突导向功能[13]。Slit/Robo主要对轴突产生排斥性导向作用，并能促进轴突的分支和延伸及引导神经细胞的迁移。Slits在果蝇和线虫中表达于中线，作为短程排斥信号分子起作用。Slit/Robo信号还与神经节的发生有关。有实验表明，小鸡三叉神经节的形成依赖基板和神经嵴细胞的相互作用：早期的颅神经嵴细胞表达Slit1，基板细胞表达其Robo2受体，通过阻断Robo2功能或通过RNA减少而干扰Robo2或Slit1，可抑制正常神经节的形成，达到类似于神经嵴切除的作用[14]。近年来发现，Slit/Robo信号通路还与机体多个系统的多种细胞迁移有关。也有研究发现，Slit/Robo信号在多种感染、损伤、肿瘤组织及其修复过程中都有表达，发挥着各不相同的作用。

2.2 Slits与疼痛

Slits家族与疼痛有关的研究甚少，2010年的一项研究表明：子宫内膜异位症伴子宫腺肌病的患者子宫内膜中Slit表达显著高于正常女性，子宫内膜异位症的女性Robo1的免疫反应活性也显著高于正常女性。而异位内膜中Slit的免疫反应活性与痛经的严重程度相关，可以作为子宫内膜异位症伴子宫腺肌病痛经程度的预测指标[15]。而Guo等[16]发现，转基因和野生型的患子宫内膜异位症的小鼠都表现出痛觉超敏或痛觉过敏，Slit2的表达和异位或者原位的子宫内膜中的微血管密度有关，Slit2的表达上调扩大了损伤部位面积并引起疼痛，但是Slit2的表达和疼痛没有统计学相关性。

Liu 等[17]通过半定量 RT-PCR、western blot、荧光染色等实验方法发现脊髓损伤后，Slit-2和Robo1的表达水平显著上升并在第14天达到高峰，但没有证据表明Slit/Robo信号与疼痛相关。为阐述Slit/Robo信号与疼痛之间的关系尚需大量基础研究。

3 Netrins

3.1 Netrins的结构及作用

Netrin是秀丽线虫中UNC-6蛋白的同源物。目前发现了四种 Netrin：Netrin-1、Netrin-2、Netrin-3、Netrin-4 在动物脊髓有表达。Netrin有两种膜结合受体，即排斥性受体（UNC-5蛋白）和吸引性受体，其中，吸引性受体主要包括结 肠 癌 缺 失（deleted in colorectal cancer，DCC） 蛋 白 、Neogenin 蛋白、UNC-40、Frazzled 等[18]。 Netrin-1 及其跨膜蛋白DCC受体信号在神经系统发育过程中能调节突触生长，但其信号的功能在神经系统发育成熟后尚不清楚。

3.2 Netrins与疼痛

现阶段，Netrin家族及其受体关于疼痛的研究甚少，但Netrin-1和DCC受体被认为与突触可塑性密切相关。在正中神经横切的小鼠模型中，Netrin-1表达增加，并在损伤两周后达到高峰，提示Netrin-1与神经损伤后的神经纤维再生密切相关[19]。Netrin-1作用于DCC受体使其激活，通过磷脂酶 C（phospholipase C，PLC）激活蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC），使Src酪氨酸激酶介导的N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体磷酸化，进而增强长时程增强效应（long-term potentiation，LTP）[20-21]。

收集34例患者后路关节融合术取出的病变椎间盘作为实验组，以尸检获得的8块正常椎间盘作为对照组，发现病变的椎间盘从外纤维环到髓核，Netrin-1和DCC受体有大量分布；而在正常椎间盘中，Netrin-1以及DCC分布显著少于病变的椎间盘，说明Netrin-1以及DCC的表达增多可能引导神经及血管长入椎间盘而导致慢性腰背痛[22]。笔者认为，Netrin-1在退行性变的椎间盘中起到了和Sema3A相反的作用，Sema3A对神经血管的长入起到屏障作用；而Netrin-1及其DCC受体则引导神经血管的长入从而引起慢性腰背痛。

4 Ephrins

4.1 Ephrins的结构与作用

目前在哺乳动物体内发现至少9种Ephrin（配体）和14种Eph（受体）。Ephrin被分为两种类型：EphrinA1～EphrinA6和EphrinB1～EphrinB3，其受体Eph是酪氨酸激酶受体家族的巨大分支。Eph受体根据其同源性和配体亲和力又分为两个亚族：A亚族（EphA1～EphA8，EphA10）和 B亚族（EphB1～EphB4，EphB6）[23]。 Eph 受体及其配体间的相互作用参与了胚胎发育过程中的许多进程，在神经轴突导向、血管发生、肿瘤形成等方面都具有重要作用。近年来，相当一部分研究表明Ephs/Ephrins与疼痛有关。

4.2 Ephrins与疼痛

4.2.1 Ephrins与神经病理性痛

4.2.1.1 在神经病理性痛模型中Song等[24]发现神经损伤能诱导背根神经节（dorsal root ganglion，DRG） 及脊髓中EphB1（受体）、EphrinB1（配体）上调，鞘内注射 EphB 受体激动剂可以导致热痛觉超敏，并增强DRG小神经元的兴奋性以及C纤维、脊髓背角（dorsal horn，DH）神经元之间的LTP。而鞘内注射EphB受体拮抗剂可以消除神经损伤所导致的热痛觉过敏及机械痛超敏，并抑制DRG感觉神经元和DH神经元的兴奋性，减弱C纤维及背角神经元突触之间的LTP[25]，说明EphB1/EphrinB1信号通过调节神经元兴奋性以及脊髓突触的可塑性介导神经病理性痛。进一步研究证实，EphrinB1-Fc（EphB受体激动剂）鞘内注射引起周围神经中磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）表达上调，同时AKT的磷酸化也增加，认为PI3K-AKT信号通路与EphrinB-Fc介导的痛觉超敏密切相关[25]。受体EphB活化后，激活PI3K-AKT信号通路，通过磷酸化AKT，影响突触可塑性和再分布，导致神经病理性痛。还有实验表明，在神经损伤导致的神经痛模型中，DRG和脊髓中EphrinB2表达上调，同时其受体EphB1也在脊髓中表达[26]。EphrinB2基因敲除的大鼠热痛觉过敏及机械痛超敏也显著降低[27]。说明EphrinB2/EphB1信号转导通路可能调节突触的可塑性和再分布。

4.2.1.2 也有实验认为，MAPK信号在神经病理性痛的发生过程中起到下游效应作用。鞘内注射EphrinB1-Fc可以诱导时间及剂量依赖的热痛觉过敏和机械痛超敏，同时使脊髓中MAPK磷酸化增加、c-Fos蛋白表达上调；MAPK抑制剂可以减少由鞘内注射EphrinB1-Fc引起的热痛觉过敏和机械痛超敏[28]。EphrinBs/EphBs信号参与感觉信息的调控及中枢敏感化，还有实验证明，EphrinBs/EphBs与周围神经敏感化有关。小鼠足跖感染EphrinB1-Fc诱导时间、剂量依赖的热痛觉过敏与机械痛超敏，并且伴随脊髓中c-Fos蛋白表达上调、MAPK磷酸化[29]。

4.2.1.3 小胶质细胞的激活与神经病理性痛的诱发密切相关，在神经损伤后第7天其激活数量下降，提示由EphrinB2作用于伤害性感受器的信号是导致脊髓中小胶质细胞的激活的关键。然而，EphrinB2作用的出现明显是在神经损伤导致的神经病理性痛之后，这说明EphrinB2信号可能不是小胶质细胞激活的主要原因[11]。此外，细胞骨架的改变与突触可塑性的改变密切相关，突触可以利用肌动蛋白的功能对突触形态进行动态调节，并可以通过改变肌动蛋白聚集和解聚信号来调节突触前后小体的功能，这可能与神经病理性痛的发生和维持有关[30]。

4.2.1.4 在基因水平上，Cibert-Goton等[31]观察到EphB1基因敲除和野生型的小鼠中均出现了痛觉过敏或痛觉超敏，但是前者恢复较快，这表明EphrinB/EphB信号对神经病理性痛的维持起到了重要作用，提示该信号为神经病理性痛的治疗提供了潜在的靶点。

4.2.2 Ephrins与癌性痛

在Walker256乳腺癌细胞胫骨骨髓腔移植的骨癌痛模型中，EphrinB1/EphB1在脊髓中表达显著升高，并且在肿瘤细胞接种的 16 d后，IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子的mRNA表达也显著升高，而鞘内注射EphB1受体拮抗剂EphB1-Fc能显著减轻骨癌痛，并且相应炎性因子的表达能被鞘内注射EphB1-Fc所翻转。这表明EphrinB1/EphB1受体可能通过上调炎症因子表达参与骨癌痛的形成[32]。Liu等[33]发现，在Src酪氨酸激酶的介导下，NMDA受体的亚基NR1及NR2B被磷酸化，激活NMDA受体，使下游钙离子依赖的信号通路激活，最终导致骨癌痛，实验中EphB1受体拮抗剂可以达到与吗啡治疗骨癌痛相似的镇痛作用，这为骨癌痛的治疗提供了一个可能的靶点。而Z360（一种口服胆囊收缩素受体拮抗剂）在治疗胰腺癌导致的疼痛中，可以出现与EphB1受体拮抗剂相似的效果，Z360通过减少IL-1β的产生下调EphrinB1基因表达以及NR2B受体的磷酸化[34]。过度表达的炎性因子如何作用于NMDA受体导致癌症痛的机制还不清楚。

4.2.3 Ephrins与炎性痛

炎性痛的主要特征是正常的无害刺激亦引起疼痛。同样在EphrinB2基因敲除小鼠模型中，由完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）诱导的炎性机械痛觉超敏减少，由福尔马林诱导的第二阶段痛行为反应显著减少，并且这种疼痛减轻和NMDA受体亚单位NR2B的磷酸化减弱有关[27]。Slack等[35]认为，通过Src家族酪氨酸激酶介导EphB受体活化，使NMDA受体的NR2B亚单位磷酸化，从而导致炎性痛的发生。鞘内注射EphB受体激动剂ephrinB2-Fc也体现了这种作用；并且以上一系列反应可以被Src家族酪氨酸激酶的阻滞剂PP2所抑制，用PP2预处理的实验动物也没有出现EphrinB2-Fc介导的疼痛反应。目前仅知在炎性痛过敏过程中，EphrinB2与Eph（受体）相互作用，可导致NMDA受体的亚基NR2B磷酸化，而该过程通过激活Src酪氨酸激酶的介导下完成，这也可能是一些神经病理性痛的病理机制。

4.2.4 Ephrins与其他类型的疼痛

跨器官痛觉致敏，即一个病变内脏器官的疼痛引起另一个相邻正常器官痛觉敏感化，进而导致后者的功能异常[36]。内脏痛一般有以下特点：属于慢性疼痛（缓慢、持久且定位不精确，对刺激分辩力差）；对切割、烧灼等刺激不敏感，对牵拉、缺血、痉挛等异常敏感；常伴有内脏-躯体牵涉痛。临近器官相互关联的神经通路和跨器官反射，构成了发生跨器官痛觉致敏的解剖生理基础[37]。Peng等[38]通过结肠内灌注芥子油（mustard oil，MO）制备了结肠-尿道反射致敏的模型，发现EphrinB2通过NMDA受体NR2B亚单位的磷酸化介导结肠-尿道跨器官痛觉致敏并引起慢性盆腔疼痛，这与Wu等[39]发现一致。在腰骶段背角，EphrinB2/EphB受体相互作用，通过介导NMDA受体NR2B亚基的磷酸化，使解剖、生理基础发生变化，引起跨器官痛觉敏化，最终引起盆部脏器的疼痛，并且以上一系列反应可以被Src家族酪氨酸激酶的阻滞剂PP2所抑制[39]。笔者认为，EphrinB2与Eph（受体）相互作用，可导致NMDA受体的亚基NR2B磷酸化，而该过程通过激活Src酪氨酸激酶的介导下完成，同时这也可能是一些神经病理性痛的病理生理机制。对跨器官痛觉致敏的病理生理的研究，有助于解释消化道和泌尿生殖道功能障碍及其引起的慢性非特异性盆腔疼痛，为慢性非特异性盆腔疼痛的诊断及治疗提供了新思路。

5 结语

轴突导向因子不仅在神经系统的发育过程中起到重要的导向作用，也和成年后的疼痛关系密切，轴突导向因子在此方面展现了巨大的潜力。但轴突导向因子参与疼痛发生的机制还需要大量的基础科研工作进行深入研究，例如退行性变的腰椎间盘中，Netrins与Semaphorins都可能参与了慢性腰背痛的进程，但是二者关系如何尚不得知；EphrinBs/EphBs信号广泛参与疼痛进程，其下游机尚不清楚。大量研究表明，Slit2/Robo1在脊髓损伤之后表达显著增高，而Slits家族与疼痛之间关系的研究很少。本文综述了最新的关于疼痛和轴突导向因子之间关系的研究，希望能为疼痛性疾病的治疗提供潜在的靶点。轴突导向因子参与疼痛发生的机制还需要大量的基础科研工作进行深入研究，以更好地指导疼痛的靶向治疗。

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