多肽类药物代谢研究进展

姚金凤，白 露，宋亚芳，薛 明

(首都医科大学1.燕京医学院药学系，北京 101300;2.基础医学院药理学系，北京 100069)

多肽是由氨基酸通过肽键相连构成的一类化合物，是生物体内普遍存在的化学活性物质。迄今为止，生物体内已发现的多肽达数万种，而且大多具有生理活性，如生命活动中的细胞分化、神经激素与递质调节、免疫调节及肿瘤发生等生理、病理过程均与活性多肽密切相关。多肽类药物药理活性强、疗效高，在维持机体正常功能中发挥着重要的作用。因此，利用肽类作为治疗药物已越来越引起国际医药工业界的兴趣［1］，包括利用一些合成肽作为内源性肽的类似物，或合成天然活性肽的衍生物［2］。自1982年胰岛素作为第一个来源于生物技术的多肽类药物上市以来，伴随着生物化学和分子生物学技术的飞速发展及多肽合成技术的日益成熟，基于肽和蛋白质类的药物已占临床用药的相当大一部分，如已获FDA批准的多肽类药物有:抗肿瘤药地尼白介素2、门冬酰胺酶和培门冬酶;黄体生成素释放激素(LHRH)类似物阿巴瑞克、西曲瑞克、亮丙瑞林和戈舍瑞林;抗贫血药促红细胞生成素-α、重组人红细胞生成素-α;胰岛素类似物赖脯胰岛素、门冬胰岛素和甘精胰岛素等等［3］。

然而，多肽类药物在化学结构和理化特性上又不同于小分子药物，其基本单元为氨基酸残基，其共价结合方式与蛋白质相同，因此多肽是许多蛋白水解酶的天然底物，胃肠道内的固有肽酶和蛋白酶是肽类和蛋白质代谢的最有效工具。高胃肠道酶活性和胃肠粘膜的低通透性导致多肽类药物口服给药后通常无治疗活性［4］。因此，尽管一般适用于小分子的药代动力学原理同样适用于多肽类药物，但由于多肽药物具有相对分子质量大、不易透过生物膜、易在体内酶解、其降解途径与蛋白质营养素和(或)特殊调节内源肽相似等特点，所以在药物开发过程中必须考虑与生物分析和药物代谢动力学有关的许多限制和缺陷。此外，由于肽类药物与内源性物质和受体以及调节反馈之间存在密切的相互作用，所以其药效动力学和药代动力学的关系往往比较复杂。本文就近年来国内外有关多肽类药物的代谢研究进展进行综述。

1 多肽类药物酶的代谢位点

一般蛋白和多肽类药物通过与内源性或膳食蛋白质一样的分解代谢途径被消除，即主要是受体内蛋白酶的作用而被水解代谢。按照酶切位置，可以把蛋白酶分为内肽酶和外肽酶(包括氨肽酶和羧肽酶)［5］。肽和蛋白质的水解通常起始于内肽酶，它作用于蛋白质的中间部分，酶解产生的寡肽可进一步被外肽酶降解。蛋白质的最终代谢产物，即氨基酸和二肽进入内源性氨基酸库被重新利用，用于重新合成结构性或功能性机体蛋白质［6］。

蛋白水解酶对多肽的水解反应往往具有一定的特异性或选择性，即可选择性地作用于某些氨基酸位点［7］。如胃蛋白酶只能水解肽链中由芳香族氨基酸的氨基和酸性氨基酸的羧基形成的肽键;胰蛋白酶主要作用于碱性氨基酸的羧基形成的肽键;糜蛋白酶主要水解芳香性氨基酸;弹性蛋白酶主要水解脂肪族氨基酸羧基形成的肽键;氨肽酶主要水解寡肽的氨基末端肽;羧肽酶A和B分别水解中性和碱性氨基酸的羧基末端肽［8］;二肽基肽酶IV(DPPIV)有利于N-端的第2位氨基酸残基为Ala或Pro的降解，在此位点用其他氨基酸残基替代可以减少肽的降解［9］。蛋白酶亚类中每一个具体酶对肽的水解也具有作用特异性，如谷氨酰胺氨肽酶(EC number 3.4.11.7)主要水解 N-端的 Glu 残基，而氨肽酶B(EC number 3.4.11.6)则水解寡肽 N-末端的 Arg 和 Lys残基，有关蛋白酶的作用特异性和组织分布已有比较详细的报道［10］。

2 多肽类药物在组织器官中的代谢

蛋白水解酶在机体内广泛分布，因此，具有广泛的多肽类药物代谢能力的部位不仅包括肝、肾和胃肠道组织，也包括肺、血液和血管内皮、皮肤及其他组织和器官。各组织和器官因所分布的蛋白酶种类不同、对肽类药物的摄入方式不同，所以对多肽代谢的速率和程度也有所不同。

2.1 肝脏代谢肝脏在多肽类药物代谢过程中发挥着十分重要的作用。在肝脏代谢之前，肝细胞首先要摄入多肽。对于小肽，如果肽分子本身有足够的疏水性，那么它们就可以通过被动扩散跨过肝细胞膜;分子较大的蛋白质则可以通过载体介导的转运进入细胞内;而多数水溶性的和不能通过特异机制摄入的多肽，则可通过内吞作用进入肝细胞。另有证据表明，存在于肝细胞膜上的一种受体，即低密度脂蛋白受体相关蛋白在组织型纤溶酶原激活剂的代谢中起重要作用［11］。Liao等［12］证实，鲑鱼降钙素在肝匀浆中温孵时，起始断裂位点在His17-Lys18和Val8-Leu9，其余降解产物基本由外肽酶(氨肽酶或羧肽酶)对主要降解产物或鲑鱼降钙素原型的代谢作用而产生。

2.2 肾脏的代谢消除肾脏在多肽的清除过程中具有特殊作用。肾脏的底物、生长因子、酸碱平衡及肾功能变化都会引起多肽代谢的不同。对于非口服及内源性肽和蛋白类药物，如果多肽或蛋白质的分子质量小于肾小球的滤过极限(～60 ku)，那么肾脏就是其主要消除器官。研究重组人胰高血糖素类肽-1(7-36)［rhGLP-1(7-36)］的药动学发现，给大鼠皮下注射［125I］rhGLP-1(7-36)10 min后，血浆药物浓度达峰，降解物迅速出现，此时肾脏中的总放射性浓度最高，提示肾脏对从循环中清除［125I］rhGLP-1(7-36)或其代谢物有重要作用［13］。

肽类和小分子蛋白质的肾代谢主要是通过以下两种机制介导的:(1)经肾小球滤过的大分子多肽，通过胞吞和溶酶体降解清除，最后水解成小肽碎片和氨基酸［14］。(2)经肾小球滤过的小分子多肽被近端肾小管管腔内的刷状边缘膜中的肽链端解酶水解成氨基酸，再经特异性氨基酸转运系统被重新吸收进入体循环，也可能是先断裂成小肽，再转运至近曲小管上皮细胞内，在胞内水解。这种机制消除的药物如质子驱动的肽转运蛋白PEPT1和PEPT2［15］。最近的研究对肽类药物在肾脏内代谢时的酶解位点有一些报道，如Spiegeleer等［16］研究了碘化的肥胖抑制素肽在体外血浆、肝和肾中的代谢稳定性，结果显示，与未修饰的原型肽相比，碘化的肽酶解位点与生物基质和与碘原子相连的氨基酸残基有关，酶解发生在距离碘原子较远的肽键上，而与碘原子相连的附近肽键的酶解则受到限制。Serada等［17］报道，给大鼠皮下注射特里帕肽醋酸酯后，其药代动力学结果显示，肾脏在其分布和代谢中起重要作用，但在其消除中的作用却不明显。

2.3 胃肠道代谢蛋白多肽类药物一般口服给药无效，这主要是胃肠道内存在着大量降解多肽的酶类，主要有:(1)胃肠道腔内酶，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、弹性酶以及羧肽酶A和B;(2)黏膜细胞酶，主要指与刷状缘膜结合的酶类;(3)刷状缘胞液酶，包括氨基三肽酶、脯氨酸肽酶、脯氨酰肽酶、二肽酶及肌肽酶等。

其中胰蛋白酶是胃肠道主要的蛋白酶。乳铁传递蛋白(lactoferrin，LF)是存在于牛奶和其他体液中的一种蛋白，有重要的生物学作用。作为一种食物，乳铁传递蛋白必须在胃肠道环境中稳定或者产生生物活性碎片才能发挥作用。用人胃液或肠液模拟胃和十二指肠环境消化乳铁传递蛋白，结果显示，高浓度的胃液和肠液或快速降低其pH值为2.5，能引起LF在模拟胃液中完全降解;当慢慢降低其pH值为2.5或4.0时，LF能部分抵抗胃液的消化。对酶解产物进行分析，发现含有脯氨酸及邻位疏水的氨基酸残基能限制酶解过程。进一步的结构分析显示，几乎所有的酶解位点都位于表面，主要存在于LF非糖基化的部分。而且，用人蛋白酶和非人蛋白酶消化牛LF(bLF)能产生不同的肽片段［18］。

2.4 肺代谢多肽和蛋白类药物在肺泡和呼吸道中降解的程度尚不清楚，但是，已有报道证明了这一途径对于肺部蛋白消除的重要性。研究证明，肺部存在多种蛋白酶和肽酶，虽然这些蛋白酶的功能尚未知，但其中一些酶参与了蛋白质的降解。研究者在呼吸道内发现了高浓度的游离氨基酸，它们可能是蛋白质降解的产物。现已证明，在呼吸道和肺泡上皮细胞的管腔膜上存在氨基酸、肽和糖的转运体，这些转运体可能参与蛋白质降解产物从呼吸道的清除［19］。Liao等［12］研究了人甲状旁腺素(hPTH)在大鼠肝、肾和肺匀浆中的代谢，发现hPTH在这3种体系中的主要断裂位点基本一致，均为Leu15-Asn16，提示该激素在匀浆体系中的降解主要由糜蛋白酶样内肽酶酶切，继而由外肽酶(氨肽酶和羧肽酶)对主要降解片段或hPTH原型进一步酶切。我们通过研究LHRH拮抗剂十肽在大鼠肺匀浆中的代谢，证明所研究的5种新型十肽在大鼠肺匀浆中温孵4 h后，原型药物的保留百分率在20%～70%，也说明了肺在多肽类药物代谢中的作用［20］。

2.5 其他组织除了以上主要代谢组织器官外，血浆、皮肤等组织在多肽类的代谢中也发挥着重要作用。在皮肤角质层、表皮和真皮层中都存在一些内肽酶(如脱氨酶和酯酶)和外肽酶(如氨肽酶)，肽类在皮肤真皮层能被酶快速代谢。Park等［21］用LC-MS/MS方法测定了用于抗衰老的胶原五肽在大鼠皮肤匀浆中的稳定性，证实该五肽可逐步被氨肽酶降解，这对于该类药物的经皮吸收给药是一个需要克服的障碍。另外，受体介导的内摄作用在多肽代谢中也发挥重要作用。多肽和蛋白类药物绝大部分都能与受体结合，从而导致受体介导的吸收及相继的胞内代谢消除，这有别于传统的小分子药物，一般小分子药物的受体结合导致的药物消除可以忽略不计。

3 影响多肽类药物代谢的因素和提高代谢稳定性的策略

多肽药类物在体内代谢稳定性差，降解迅速，原型药物在体内代谢快，消除半衰期较短以及存留时间很短，生物利用度低。如FDA批准的溶栓药阿替普酶(activase)，静脉注射时半衰期小于5 min;重组人高血糖素(glucogon)，在静脉注射、皮下注射和肌肉注射时半衰期为8～18 min;而甲状旁腺激素类药物特里帕特(forteo)在皮下注射时半衰期只有5 min。因此，提高肽类药物的体内代谢稳定性、存留时间和生物利用度是目前国内外亟待解决的问题。

影响蛋白多肽类药物代谢消除速率的因素主要包括分子质量和分子的理化性质如分子大小、亲脂性、糖基化模式、二级和三级结构等。近年来已有许多学者进行了提高肽类药物生物利用度的研究，如Ma等［22］采用甲基、羟甲基、4-氨基丁基和3-羧基丙基分别取代α-氨氧基肽AxyP1的异丁基侧链，合成了一系列该肽的类似物，从而使其在肠和肝中的稳定性提高了8～12倍。

3.1 特定氨基酸序列由于蛋白酶和肽酶对多肽的水解往往具有一定的特异性，可选择性地作用于某些氨基酸的特定位点，如果多肽中的氨基酸残基恰好是某些蛋白酶的易作用靶点，其就很容易受蛋白酶的代谢失活。如二肽基肽酶IV(DPPIV)是一种体内广泛分布的膜结合色氨酸氨肽酶，能够酶解血浆中的多种蛋白激素，尤其是以Ala或Pro作为N-端第2位氨基酸的多肽或蛋白就更容易被其水解。一个典型例子是胰高血糖素样肽1(GLP-1)，受此酶的水解导致其在人体的半衰期只有 0.9 min［23］。

针对蛋白酶对特定氨基酸残基水解的特异性导致的肽稳定性降低，可以采取以下措施提高代谢稳定性:(1)N-端和C-端封闭;(2)D-氨基酸替代;(3)非天然氨基酸侧链替代;(4)非天然肽骨架替代，如氮杂氨基酸、N-甲基氨基酸、伪肽连接等;(5)限制肽，如环化、侧链限制、Cα-烷基化;(6)拟肽，如N-烷基甘氨酸;(7)β和γ氨基酸替代。

Dong等［24］用特异性多位点N-甲基化修饰次氯化血红素肽，增加了蛋白酶或肽酶与肽结合时的空间障碍，阻止肽和酶结合部位之间形成氢键，而这种氢键是酶识别底物所必需的，例如，有底物存在时，羧肽酶活性中心的水解活性被激活，其构象会发生明显变化。然而，因为在合适的位置酶与次血红素六肽甲基化衍生物相连，使得酶的活性要比结合原型药物时难以激活，因此增加了修饰产物的酶降解稳定性。

Taiji等［25］用氨基酸替代合成了代谢稳定的肿瘤迁移抑制素。肿瘤迁移抑制素蛋白是含有54个氨基酸的多肽，是G-蛋白偶联受体KISS1R的配体，在很多内分泌和性腺生成障碍组织调节生殖和细胞迁移通路中起重要作用。N-端切除的十肽肿瘤迁移抑制素(45-54)有3～10倍高的受体亲和能力和细胞内钙离子激活活性，但是在血清中会快速失活。采用47、50和51位选择性替代设计和合成KISS1R十肽类似物，即用氮杂甘氨酸取代了甘氨酸，51位上甘氨酸中的α-C原子用N原子取代，体外小鼠血清中的稳定性结果显示，这种取代提高了Phe50-Gly51以及Gly5-Leu52之间的酰胺键的稳定性。用其他氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、β-(3-吡啶)丙氨酸和D-色氨酸取代47位的色氨酸所得到的类似物在鼠血清中具有很好的稳定性。其中，D-Trp47取代的类似物不仅具有很高的代谢稳定性，而且具有很好的KISS1R竞争活性。

3.2 分子质量分子质量是影响肽和蛋白质代谢的重要因素，其代谢速率、消除部位和代谢机制都可随着分子质量的变化而变化。代谢速率通常随着分子质量的降低而增加，顺序依次是:大蛋白质＜小蛋白质＜肽。对于分子质量小于1 000 u的小肽，结构和亲脂性是影响代谢消除的主要因素，主要消除部位是肝;分子质量在1 000～5 000 u之间的肽，分子质量则成为影响其代谢消除的主要因素，主要代谢部位为肾，不同代谢机制之间可以交叉重叠。如前所述，分子质量小于60 ku的游离极性分子很快被肾小球滤过进入尿液。低分子质量、可溶性分子每次通过肾脏的清除率约为25%，所以对于游离在血浆中的肽，即便是对蛋白酶稳定，也会因为分子大小和物理性质而被快速清除［9］。

聚乙二醇(PEG)化增加肽的有效分子量是减少肾排泄的常用方法。其保护肽的可能机制为:(1)保护肽不受免疫监视;(2)增大分子量使肽不被肾小球滤过而清除［9］;(3)通过增加立体障碍，保护肽不受蛋白酶的降解［10］。其中减少肾小球的滤过是主要机制。Zhu等［26］用Arg-Gly-Asp修饰内皮抑素合成出一种具有抗肿瘤活性的抗血管生成肽HM-3，然后以甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯(分子质量20 ku)修饰HM-3，修饰后的产物PEG20k-HM-3在大鼠血浆中温孵48 h后仍保留 90.81%不被降解，132 h后仍有72.78%未被代谢，而未修饰前的原型药物HM-3在同样条件下温孵25 min后即被完全代谢。说明聚乙二醇修饰后的肽在血浆中的稳定性明显提高。

3.3 亲脂性增加肽的疏水性可以引起肽在体内贮存以及与细胞膜和全身疏水载体蛋白可逆结合。因为结合疏水载体蛋白(如血清白蛋白，分子量66 ku)而引起分子质量增大，所以肽不易被肾滤过消除，也不易被循环系统中的膜结合蛋白酶代谢，就被重新释放入血液，从而延长了在体内的作用时间［9］。Jordan等以脑源性神经营养因子(BNDF)的3D结构为模板，设计合成了头尾环化的低分子量五肽P1，作为BNDF类似的激动剂，P1在体外能促进小鸡感觉神经元的存活，并对血浆蛋白酶降解具有高度稳定性。以此低分子五肽为先导化合物，用烷基酰胺取代而合成的疏水类似物P6，在小鼠血浆中温孵的半衰期可超过24 h，并具有良好的透膜性［27］。

3.4 空间构象多肽的空间构象在很大程度上影响其对蛋白酶的稳定性。为了获得酶解稳定性的多肽，可以采用环化、糖基化、引入小分子化合物或内酰胺桥以及形成二硫键等方法限制或稳定肽的空间构象。

3.4.1 环化 环化能够实现肽的N-和(或)C-端修饰、减少肽结构的灵活性、减少酶对肽的降解，而不影响肽的活性和特异性。已有研究表明，双环肽比具有相同氨基酸序列的线性肽的酶解稳定性更好［28］。肽骨架环化可增强分子内氢键，减少与水溶性溶剂之间的潜在氢键，是提高抗酶解能力的有效方法。富含二硫键的肽尤其适用于这种方法，因为在环化过程中可以利用半胱氨酸残基进行自然化学连接。例如，APETx2是一种从海葵中分离出来的毒素肽，用于治疗慢性炎症性疼痛。具有42个氨基酸残基，其中有6个半胱氨酸残基。在结构上 N-端和 C-端的空间距离很小(10.8±2.4)Å，这使得该化合物能更好地通过骨架环化提高其稳定性。通过环化分别合成了含有由6、7和8个氨基酸组成的环的类似物。用胰蛋白酶消化和模拟胃液考察其降解稳定性，胰蛋白酶是特异性酶，能使APETx2的C-端Lys10，Arg24和(或)Arg31水解，而胃蛋白酶特异性较弱，较易水解疏水性和芳香族的氨基酸残基，对APETx2中的11个位点有潜在的水解能力(即羧基端的 Ala3、Ile12、Tyr13、Trp14、Phe15、Tyr16、Tyr26、Tyr32、Phe33、Leu34 和 Ala41)。稳定性实验的结果显示，尽管未环化前的原型肽在结构上折叠紧密，而且有二硫键对构象的稳定作用，但其抗胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解的能力却明显弱于骨架环化后的3个肽，原型肽在胰蛋白酶和胃蛋白酶的半衰期分别为2.8 h和5 min，在胰蛋白酶中温孵48 h后，原型仅存4%没被降解，而环化后的肽仍保留70%～80%未被降解。在模拟胃液中，原型肽2 h后被全部降解，环化肽仍有50%未被降解。两种酶中的稳定性结果说明，骨架环化能够明显提高肽的稳定性［29］。

环化不仅可以提高肽对蛋白酶的稳定性，也可以减少其他代谢酶对肽的降解。例如，用香豆素酸环化阿片肽前药，从而增加了对细胞色素P450氧化代谢的稳定性。阿片肽的环状前药H-Tyrd-AlaGlyPhed-LeuOH(DADLE)能被细胞色素P450代谢，这一代谢特征限制了其口服给药的应用。为了设计代谢稳定的DADLE环状前药，用香豆素酸环合得到DADLE类似物(CADADLE)，这一结构中含有易被CYP450氧化的修饰过的氨基酸残基。通过对比研究DADLE及其环化类似物CADADLE在大鼠肝微粒体(RLM)、豚鼠肝微粒体(GPLM)、人肝微粒体(HLM)和人重组细胞色素P450 3A4(hCYP3A4)中的代谢稳定性，结果发现阿片肽及其环化前药与RLM、GPLM和HLM共同温孵后，在氨基酸侧链上都发生了单羟基化反应;当与hCYP3A4共同温孵时，DADLE发生了类似的氧化代谢，相比之下，环化后的DADLE类似物则不是CYP450同工酶的底物，说明用香豆素酸环化后，增加了阿片肽前药对细胞色素P450氧化代谢的稳定性［30］。

3.4.2 糖基化 糖基化修饰不仅可以影响多肽的空间结构，从而增强其对蛋白酶的稳定性，而且可以与PEG化联合修饰多肽，起到减少多肽的抗原性的作用。例如，TY027(Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-Pro-Leu-Trp-NH-3＇，5＇-Bzl(CF(3))(2))是具有δ/μ-阿片受体激动剂和神经激肽-1受体拮抗剂的双功能化合物，在大鼠血清中的半衰期是4.8 h。为了获得代谢更稳定的具有止痛功能的阿片肽衍生物，Yamamoto等［31］把O-β-糖基化的丝氨酸(Ser(Glc))引入其中而得到类似 物 (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Nle-Pro-Leu-Ser(Glc)-Trp-NH-3＇，5＇-Bzl(CF(3))(2))。该类似物具有两个β-翻转的明确构象以及更有效的双功能活性，代谢稳定性明显提高，在大鼠血浆中温孵24 h后，仍有70%±9% 的原型未被代谢。

3.4.3 引入小分子化合物 在多肽结构中引入小分子化合物或桥式结构可以加固其空间结构，保护多肽不受蛋白酶的降解。例如，恩夫韦地(enfuvirtide)是一个含有36个氨基酸的多肽，能作用于病毒融合结构而抑制人免疫缺陷病毒(HIV-1)的感染，但其体内稳定性和生物利用度都很差。用所谓“碳化氢双钉针”技术将一个起稳定作用的小分子化合物植入恩夫韦地分子中，能够加固该分子中的整体α-螺旋的结构，使之抵抗蛋白酶解，与钉针临近的限制性位点的肽裂解被完全阻止［32］。

胰高血糖素样肽(GLP-1)具有降低血糖水平的作用，是用于治疗二型糖尿病的有效药物。但它在体内容易受二肽基肽酶IV(DPPIV)和中性内肽酶(neprilysin，NEP，EC3.4.24.11)的降解而失活。二肽酶抑制剂可以用来解决DPPIV的快速代谢问题，而中性内肽酶因为作用于GLP-1序列上的多个位点，所以抑制其酶解作用比较困难。为克服这一难题，Murage等［33］合成了多个内酰胺桥构象限制的GLP-1类似物，用来同时稳定N-和C-端的α-螺旋。结果显示，内酰胺桥通过固定α-螺旋结构，增强了与受体的相互作用，提高了GLP-1对受体的活化能力(超过5倍);而且可以保护GLP-1不易被酶降解，使其半衰期超过96 h。

4 结语

由于多肽类药物结构与小分子药物本质上的不同，导致其具有生物半衰期短、表观分布容积小、首过效应显著、生物利用度低等特点，所以对多肽类药物的代谢和解释常面临更多的挑战，并且与小分子候选药物相比需要更多的资源。其中最主要的挑战是:多肽类药物口服生物利用度低、难以从大量相似的内源性分子中鉴定出来进行量化。解决这一难题的策略除了上述所提到的化学结构的修饰外，通过处方手段克服生理障碍也是目前研究的热点，如联合应用蛋白酶抑制剂和吸收促进剂，增强多肽在体内的稳定性和肠吸收;应用纳米制剂和脂质体等缓控释剂型、各种载体输送系统以解决多肽类的口服输送问题;改变给药途径，如采用鼻腔给药和吸入给药。

［1］ Ocak M，Helbok A，Rangger C，et al.Comparison of biological stability and metabolism of CCK2 receptor targeting peptides，a collaborative project under COST BM0607［J］.Eur J Nucl Med Mol Imaging，2011，38(8):1426-35.

［2］ Van den Broek I，Sparidans R W，Schellens J H，Beijnen J H.Quantitative bioanalysis of peptides by liquid chromatography coupled to(tandem)mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2008，872(1-2):1-22.

［3］ Moos W H.Strategy and drug research［M］.Beijing:Science Press，2007:579-80.

［4］ Tang L，Persky A M，Hochhaus G，et al.Pharmacokinetic aspects of biotechnology products ［J］.J Pharm Sci，2004，93(9):2184-204.

［5］ 廖 沙.几类合成肽的代谢性质和检测技术研究［D］.北京:军事医学科学院毒物药物研究所，2008.

［5］ Liao S.Investigation on metabolism properties and detection technique of several classes synthesis peptides［D］.Beijing:Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology，2008.

［6］ (美)Bernd Meibohm著.生物技术药物药代动力学［M］.程远国等译.北京:人民军医出版社，2010:24-5.

［6］ Bernd Meibohm(America).Pharmacokinetics and pharmacodynamics of biotech drugs-Principles and cases studies in drug developmeng［M］.Cheng Y G，et al，translation.Beijing:People＇s Military Medical Press，2010:24-5.

［7］ 厉保秋.多肽药物研究与开发［M］.北京:人民卫生出版社，2011:6.

［7］ Li B Q.Peptide drugs research and development［M］.Beijing:People＇s Medical Publishing House，2011:6.

［8］ 吴梧桐.生物化学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:282.

［8］ Wu W T.Biochemistry［M］.Beijing:People＇s Medical Publishing House，2001:282.

［9］ Moos W H.Strategy and drug research［M］.Beijing:Science Press，2007:584-8.

［10］ Werle M，Bernkop-Schnürch A.Strategies to improve plasma half time of peptide and protein drugs［J］.Amino Acids，2006，30(4):351-67.

［11］ Authier F，Posner B I，Bergeron J J.Endosomal proteolysis of internalized proteins［J］.FEBS Lett，389(1):55-60.

［12］ Liao S，Qie J K，Xue M，et al.Metabolic stability of human parathyroid hormone peptide hPTH(1-34)in rat tissue homogenates:kinetics and products of proteolytic degradation［J］.Amino Acids，2010，38(5):1595-605.

［13］白 静，余 刚，刘秀文，等.重组人胰高血糖素类肽-1(7-36)的药动学与组织分布［J］.中国药理学通报，2011，27(1):62-5.

［13］ Bai J，Yu G，Liu X W，et al.The pharmacokinetics and tissue distribution of recombinant human glucogon-like peptide 1(7-36)［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(1):62-5.

［14］ Maack T，Park C，Camargo M.Renal filtration，transport and metabolism of proteins［M］//Seldin D，Giebisch G(Eds.)，The Kidney.New York:Raven Press，1985:1773-803.

［15］ Inui K，Terada T，Masuda S，et al.Physiological and pharmacological impilcations of peptide transporters，PEPT1 and PEPT2［J］.Nephrol Dial Transplant，2000，15:11-3.

［16］ De Spiegeleer B，Van Dorpe S，Vergote V，et al.In vitro metabolic stability of iodinated obestatin peptides［J］.Peptides，2012，33(2):272-8.

［17］ Serada M，Sakurai Tanikawa A，Igarashi M，et al.The role of the liver and kidneys in the pharmacokinetics of subcutaneously administered teriparatide acetate in rats［J］.Xenobiotica，2012，42(4):398-407.

［18］ Furlund C B，Ulleberg E K，Devold T G，et al.Identification of lactoferrin peptides generated by digestion with human gastrointestinal enzymes［J］.J Dairy Sci，2013，96(1):75-88.

［19］ Mager S，Sloan J.Possible role of amino acids，peptides，and sugar transporter in protein removal and innate lung defense［J］.Eur J Pharm，2003，479(1-3):263-7.

［20］ Yao J F，Zhou N，Lv Y J，et al.Metabolic stability of long-acting luteinizing hormone-releasing hormone antagonists［J］.Amino Acids，2012，43(4):1557-66.

［21］ Park E J，Kim M S，Choi Y L，et al.Liquid chromatography-tandem mass spectrometry to determine the stability of collagen pentapeptide(KTTKS)in rat skin［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，905:113-7.

［22］ Ma B，Yin C，Yang D，et al.Effect of structural modification on the gastrointestinal stability and hepatic metabolism of a-aminoxy peptides［J］.Amino Acids，2012，43(5):2073-85.

［23］ Zhu L，Tamvakopoulos C，Xie D.et al.The role of dipeptidyl peptidase IV in the cleavage of glucagon family peptides-In vivo metabolism of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-(1-38)［J］.J Biol Chem，2003，278(25):22418-23.

［24］ Dong Q G，Zhang Y，Wang M S.Improvement of enzymatic stability and intestinal permeability of deuterohemin-peptide conjugates by specific multi-site N-methylation ［J］.Amino Acids，2012，43(6):2431-41.

［25］ Asami T，Nishizawa N，Ishibashi Y，et al.Serum stability of selected decapeptide agonists of KISS1R using pseudopeptides［J］.Bioorg Med Chem Lett，2012，22(20):6391-6.

［26］ Zhu B l，Xu H M，Zhao L M，et al.Site-specific modification of anti-angiogenesis peptide HM-3 by polyethylene glycol molecular weight of 20 kDa［J］.Biochem，2010，148(3):341-7.

［27］ Fletcher J M，Hughes R A.Modified low molecular weight cyclic peptides as mimetics of BDNF with improved potency，proteolytic stability and transmembrane passage in vitro［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(7):2695-702.

［28］ Baeriswyl V，Heinis C.Phage selection of cyclic peptide antagonists with increased stability toward intestinal proteases［J］.Protein Eng Des Sel，2013，26(1):81-9.

［29］ Jensen J E，Mobli M，Brust A，et al.Cyclisation increases the stability of the sea anemone peptide APETx2 but decreases its activity at acid-sensing ion channel 3［J］.Mar Drugs，2012，10(7):1511-27.

［30］ Nofsinger R，Fuchs-Knotts T，Borchardt R T.Factors that restrict the cell permeation of cyclic prodrugs of an opioid peptide，part 3:Synthesis of analogs designed to have improved stability to oxidative metabolism［J］.J Pharm Sci，2012，101(9):3486-99.

［31］ Yamamoto T，Jacobsen N E，Vagner J，et al.Improving metabolic stability by glycosylation:bifunctional peptide derivatives that are opioid receptor agonists and neurokinin 1 receptor antagonists［J］.J Med Chem，2009，52(16):5164-75.

［32］ Bird G H，Madani N，Perry A F，et al.Hydrocarbon double-stapling remedies the proteolytic instability of a lengthy peptide therapeutic［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(32):14093-8.

［33］ Murage E N，Gao G Z，Bisello A，et al.Development of potent glucagon-like peptide-1 agonists with high enzyme stability via introduction of multiple lactam bridges［J］.J Med Chem，2010，53(17):6412-20.